蝸牛水解液的制備及其乳酸發酵飲料的研究

張甜甜， 陳存社， 侯建軍， 任雅琳

(北京工商大學食品學院，北京 100048)

蝸牛水解液的制備及其乳酸發酵飲料的研究

張甜甜， 陳存社， 侯建軍， 任雅琳

(北京工商大學食品學院，北京 100048)

用堿性蛋白酶對白玉蝸牛肉進行水解，探討了水解溫度、pH值、加酶量及固液比對蝸牛肉水解液水解得率的影響，通過正交試驗確定了蝸牛肉水解的較佳條件，并以水解液為原料進行乳酸菌發酵，獲得較佳的飲料制備工藝．結果表明:以堿性蛋白酶為水解酶，水解工藝條件為，溫度50℃，pH 10.5，料液比1∶5，加酶量6 000 U/g，水解3 h后加1%風味蛋白酶水解1 h時水解度為7.13%．水解液乳酸菌發酵的較佳工藝條件為:115℃高溫滅菌15 min，蔗糖添加量5%，乳糖添加量2%，乳酸菌接種量3% ～4%，時間6 h．

蝸牛;水解度;發酵;飲料

白玉蝸牛，也稱褐云瑪瑙螺，是陸生貝殼類的軟體動物，屬腹足綱，原產于非洲東部．白玉蝸牛肉質鮮美，營養豐富，含有20多種氨基酸 ，可以加工為多種食品和保健品，具有較高的食用和藥用價值［1－2］．據分析:100 g褐云瑪瑙螺干肉含蛋白質60.42 g，脂肪 3.85 g，粗纖維 4.5 g，無氮浸出物18.9 g，灰分 9.6 g，以及鈣、磷、生物堿、酚類、鞣酸、肉酯、香豆精、有機酸和維生素等，還含有大量的硒、硼、鋅等微量元素［3］．以蝸牛肉為原料 ，采用酶解生產的蝸牛蛋白水解液，還可用作高級調料或調配成保健品直接飲用［4］．此外，蝸牛肉經過酶解得到的蝸牛全營養液蛋白質和氨基酸含量高，適當添加該提取液可以提高食品、化妝品的價值［5－7］．

我國是蝸牛養殖大國，資源極為豐富．蝸牛主要以烹調為主，少量用于藥品和其他方面．目前，市場上主要的蛋白水解液為植物蛋白水解液，其氨基酸組成和比例都與人體需求差異較大．動物蛋白水解液與人體氨基酸組成相似，但由于原料安全得不到保障，市場上動物源水解液較少．宋煥祿［8］等利用鹽酸水解蝸牛肉粉后中和得到的蝸牛蛋白水解液蛋白水解率高，氨基酸態氮得率達50%．郭玉華［9］和白鳳翎［10］利用菠蘿蛋白酶水解牡蠣蛋白，并用乳酸菌發酵水解液得到乳酸發酵飲料，其中含有大量的低分子多肽，易吸收，而且蛋白水解物也能促進乳酸菌的增殖．劉姝［11］等利用米曲霉 Aspergillus oryzae AS3.951發酵太平洋牡蠣，制備水解液，也是動物水解液的新探索．張昌奎［12］等利用Protamex Flavourzyme酶水解蝸牛肉并對水解液進行了脫色和脫腥研究，得到色澤淺、無腥味的蛋白水解液．利用堿性蛋白酶水解蝸牛肉的研究較少，并且利用蝸牛肉水解液進行乳酸菌發酵得到發酵飲料也是本研究的創新點．利用酶水解的動物蛋白水解液不僅營養價值高，口味較好，其乳酸菌發酵飲料也利于腸道吸收，可以實現蝸牛的高值化利用，為蝸牛乳酸菌飲料的開發利用提供理論依據和實踐指導．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料

白玉蝸牛，購自北京市海淀區四道口水產批發市場;脫脂奶粉，完達山產品(批號:3601B412);脫脂牛奶培養基，用于菌種活化和短期傳代保存．

1.1.2 酶制劑

堿性蛋白酶，北京奧博星生物技術有限公司，活力20萬U/g;風味蛋白酶，諾維信公司．

1.1.3 試劑

乳糖、蔗糖，其他試劑均為國產分析純．

1.1.4 菌種

嗜熱鏈球菌(S．theumopHilus，St)，由中科院微生物所提供;

保加利亞乳桿菌(L．bulgaricus，Lb)，由中科院微生物所提供．

1.2 實驗儀器

DS－1型高速組織搗碎機，上海標本模型廠 ;HH－2型數顯恒溫水浴鍋，杰瑞爾電器有限公司;PHS－3D型精密pH計，上海精密科學儀器有限公司;HJ－1型磁力攪拌器，江蘇金壇醫療儀器廠;Scout型電子天平，奧豪斯國際貿易有限公司;LRH－250型生化恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫療設備有限公司;超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;高剪切均質乳化機;上海世赫機電設備有限公司;Himac CR22G型高速冷凍離心機，日本Hitachi公司．

1.3 實驗方法

1.3.1 蝸牛蛋白的酶水解［4］

將靜養2 d的蝸牛用水清洗干凈，放入沸水中，30 s后取出，將蝸牛肉取出，稱取一定量的蝸牛肉加入不同比例去離子水，用絞肉機將蝸牛肉絞碎．調節蝸牛肉的pH值，以堿性蛋白酶為水解酶，在不同的水解溫度、加酶量和固液比條件下分別酶解3 h，加入1%的風味蛋白酶繼續酶解1 h以改善酶解液風味［13］．酶解液95℃水浴5 min滅酶，酶解液5000 r·min－1離心 10 min 后得清液備用．

1.3.2 蝸牛蛋白水解條件優化

在單因素實驗的基礎上，選用堿性蛋白酶的水解溫度、pH值、酶添加量和固液比作為試驗因素，如表1．選取L9(34)正交試驗探討堿性蛋白酶水解的較佳工藝條件．

1.3.3 水解度的測定

分別采用凱氏定氮法［14］和中性甲醛滴定法［15］測定蝸牛肉蛋白總氮含量和水解液中游離氨基態氮含量．

表1 L9(34)堿性蛋白酶水解正交試驗設計Tab．1 Design of L9(34)alkali protease hydrolysis orthogonal test

1.3.4 蝸牛水解液的調配

實驗發現，單獨發酵蝸牛酶解液時因糖的缺乏會導致乳酸菌不能很好地生長繁殖，也不能產生足夠的乳酸，加入蔗糖、乳糖可使乳酸菌充分生長繁殖，發酵產酸，增加產酸量［16］．因此添加不同濃度的蔗糖和乳糖調配后滅菌進行乳酸菌發酵．

1.3.5 蝸牛水解液乳酸菌發酵［17］

根據發酵型乳酸菌飲料制備方法，將獲得的蝸牛水解離心上清液，分別加入不同質量分數的蔗糖和乳糖調配，在115℃高溫滅菌15 min，冷卻后按嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌的比例為St∶Lb=1∶1，接種量為3% ～4%，42 ℃培養，分別發酵 4，5，6，7，8 h．測定發酵液的pH值和酸度，并進行感官評分．

1.3.6 滅菌溫度對蝸牛乳酸菌發酵飲料的影響實驗

為確定蝸牛水解液發酵飲料的最佳滅菌溫度，將蝸牛水解液添加一定量白砂糖和乳糖調配后分別在115℃和120℃滅菌15 min，迅速冷卻，觀察蝸牛水解液的狀態．

1.3.7 發酵時間對發酵型蝸牛乳酸菌飲料的影響實驗

為研究不同發酵時間對蝸牛水解液發酵飲料產品的質量和口感的影響，將水解液調配后滅菌，接種乳酸菌后在42 ℃發酵 4，5，6，7，8 h，測定不同發酵時間發酵液pH值和酸度，并進行感官評分．

1.3.8 發酵液酸度的測定

分別采用pH計和滴定法［18］測定乳酸菌發酵液的pH值和酸度．

1.3.9 發酵液沉淀率SR的測定［19］

在產品貯藏幾天后，對產品進行離心沉淀測試．稱取10 mL樣品到離心管中，常溫下以3 000 r/min的轉速旋轉10 min，離心后倒出上層液體，再將離心管倒置5 min后稱重．每個樣品進行3次平行測定，結果取平行測定的平均值．

2 結果與討論

2.1 堿性蛋白酶水解條件的優化結果

堿性蛋白酶水解蝸牛肉的正交試驗結果如表2．由表2可以看出，影響水解度的主次因素是:D＞A＞B＞C，即固液比＞水解溫度＞pH＞加酶量．試驗結果表明，水解得率最高的酶解工藝組合為A3B2C1D1，水解度為7.13%．因此確定了堿性蛋白酶水解蝸牛肉的較佳酶解條件:水解溫度50℃，pH 10.5，料液比1∶5，加酶量 6 000 U/g，為改善蝸牛水解液的風味，在堿性蛋白酶水解3 h后加入1%風味蛋白酶繼續水解1 h．

表2 L9(34)堿性蛋白酶水解正交試驗結果Tab．2 L9(34)Alkali protease hydrolysis orthogonal test results

2.2 蝸牛水解液乳酸飲料發酵結果分析

2.2.1 蝸牛水解液調配中乳糖添加量對蝸牛乳酸發酵飲料的影響

蝸牛酶水解液中含糖量較少，發酵蝸牛水解液時因糖的缺乏會導致乳酸菌不能很好地生長繁殖，因此也不能產生足夠的乳酸．加入蔗糖、乳糖可使乳酸菌充分生長繁殖，發酵產酸，增加產酸量．加入不同含量乳糖和蔗糖后蝸牛乳酸菌發酵6 h后的pH值、酸度和感官評價如表3和表4．

由表3看出，隨著乳糖添加量的增加，滴定酸度逐漸增加，當乳糖添加量大于2%時，滴定酸度上升趨勢比較緩慢，因此乳糖添加量在2%時較佳．

表3 乳糖添加量對蝸牛乳酸菌發酵飲料的影響Tab．3 Effect of lactose content on snail lactobacillus fermented beverage

表4 蔗糖添加量對蝸牛乳酸菌發酵飲料的影響Tab．4 Effect of sucrose content on snail lactobacillus fermented beverage

加入適當的蔗糖可以為乳酸菌提供碳源，促進乳酸菌的生長繁殖，發酵產酸，增加產酸量，使產品產生良好的風味和口感．若添加量過大，會產生高滲透壓，抑制乳酸菌的生長繁殖;添加量過小，風味較差．由表4可以看出，隨著蔗糖添加量的增加，感官評分升高，當蔗糖添加量為5%，感官評分較高，與蔗糖添加量為7%的感官評分無顯著性差異．

2.2.2 滅菌溫度對蝸牛乳酸菌發酵飲料的影響

為研究滅菌溫度對蝸牛乳酸菌發酵飲料的影響，將蝸牛水解液添加一定量蔗糖和乳糖調配后，分別在115℃和120℃條件下滅菌，持續15 min，迅速冷卻，觀察蝸牛水解液的狀態．發現在115℃滅菌后蝸牛液的色澤較好，無沉淀，在120℃滅菌后有大量褐色沉淀，因此確定蝸牛水解液的滅菌條件為115 ℃，15 min．

2.2.3 發酵時間對發酵型蝸牛乳酸菌飲料的影響

將調配好的蝸牛水解液滅菌后，接種乳酸菌發酵，測定不同發酵時間發酵液pH值和酸度，并進行感官評分，結果見表5．

由表5可見，發酵時間對產品的質量和口感都有較大的影響，時間過短，風味不足，口感較差;時間過長，產酸量過多，風味不佳，生產效率較低，生產成本過高．當然，最佳的發酵時間與發酵劑的活力和發酵溫度有密切關系，生產中應根據實際情況確定．從表5綜合考慮感官評分和生產效率，時間達6 h為較佳發酵時間．

表5 發酵時間對蝸牛乳酸菌發酵飲料的影響Tab．5 Effect of fermentation time on snail lactobacillus fermented beverage

2.2.4 蝸牛水解發酵飲料出現的問題

通過多次蝸牛水解發酵飲料的制備實驗發現，隨著發酵時間的延長，蝸牛發酵飲料會出現沉淀和分層現象．產品貯藏幾天后，對產品進行離心沉淀測試．發現調配好的蝸牛水解液在42℃發酵9 h，冷凍12 h后沉淀率達2.3%，而一般地，產品離心沉降率在1%以內認為比較穩定［20］，大于1%的，越大越不穩定．為降低飲料的沉淀率和提高發酵飲料的穩定性［21］，在飲料中加入不同含量的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，發現隨著CMC-Na添加量增加，離心沉淀率先降低后增加，穩定劑的添加量超過一定值時，反而引起乳酸菌發酵飲料更加不穩定，其主要原因可能是，穩定劑加入過多，飲料顆粒表面吸附的穩定劑鏈節數會過多或鏈節的吸附占極大優勢，沉淀會從穩定劑分子上解吸［22］．

3 討論

本實驗選用堿性蛋白酶對白玉蝸牛肉水解，并通過正交試驗對水解條件進行優化，確定了蝸牛肉水解的較佳條件．蝸牛水解液中含有大量的短分子多肽，利用蝸牛水解液添加5%蔗糖和2%乳糖調配的蝸牛水解液滅菌后接種乳酸菌發酵，并研究了乳糖和蔗糖添加量對乳酸發酵飲料口味的影響．發現在蔗糖添加量5%，乳糖添加量2%，乳酸發酵飲料的酸度和口味較好．在實驗中出現了蝸牛水解液在發酵過程中的沉淀和不穩定問題．發酵型蝸牛飲料的營養成分分析和其貯存過程中出現的問題將是以后研究中應重點研究的方向．此外蝸牛乳酸菌飲料的保健作用也有待進一步研究．

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(責任編輯:葉紅波)

Study on Preparation of Snail Hydrolyzate and Application in Fermentation Beverage

ZHANG Tian-tian， CHEN Cun-she， HOU Jian-jun， REN Ya-lin
(School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

Hydrolysis of snail meat with alkali protease was determined by orthogonal test and the application of snail hydrolyzate in fermentation beverage were studied．The optimal conditions of snail meat hydrolysis were temperature 50℃，pH 10.5，solid-liquid rate 1∶5，and alkali protease dosage of 6000 U/g．After 3 h of hydrolysis，1%of flavourzyme was added to improve the flavor．Supernatant of hydrolyzate was sterilized at 115℃ for 15 min．With fermentation at temperature 40℃，sugar 5%，inoculum 3% －4%，and lactose 2%for 6 h，the beverage obtained had good color and flavour，and also showed high stability．

snail;degree of hydrolysis;fermentation;beverage

TS251;TS275.4

A

1671-1513(2012)06-0063-04

2012-02-22

北京市教委科技發展計劃項目(KZ20110011013);學科與研究生教育重點學科應用化學資助項目(PXM2012_014213_000038)．

張甜甜，女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程;

陳存社，男，教授，博士，主要從事發酵食品方面的研究．通訊作者．