紅曲霉液態發酵多糖工藝條件的優化

伍健萍， 王昌祿， 陳勉華， 王玉榮， 李風娟

(天津科技大學食品營養與安全教育部重點實驗室/食品工程與生物技術學院，天津 300457)

紅曲霉液態發酵多糖工藝條件的優化

伍健萍， 王昌祿， 陳勉華， 王玉榮， 李風娟

(天津科技大學食品營養與安全教育部重點實驗室/食品工程與生物技術學院，天津 300457)

研究了紅曲霉產多糖的液態發酵條件，得出優化后的培養基組成為:蔗糖45 g/L，酵母粉4.5 g/L，KH2PO4·3H2O 3.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.85 g/L．通過單因素實驗和正交試驗，得到紅曲霉N產多糖的優化發酵工藝條件為:種齡30 h，接種量7.5%，發酵培養基初始pH 5.75，裝液量162.5 mL/1 000 mL三角瓶，發酵時間84 h．在此條件下，紅曲霉液態發酵的多糖質量濃度達999.8 mg/L，比優化前的684.2 mg/L提高46.1%．

紅曲霉;多糖;液態發酵;條件優化

紅曲霉(Monascus sp．)是我國傳統發酵產品——紅曲的生產菌種．紅曲霉接種于米飯培養基經發酵后的產物稱為紅曲，也稱為神曲或丹曲，在我國有上千年的應用歷史，主要用作食品發酵劑、著色劑、防腐劑、增香劑及中藥配伍．

多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，通常是細胞表面信號識別、抗原抗體反應、細胞間信息傳遞和感受的關鍵因子［1］，具有免疫調節、抗腫瘤、抗癌、抗氧化、抗病毒、降血糖、降血脂等藥理作用［2－10］．紅曲霉能產Monacolin K、GABA等多種生物活性物質，Tian Jun等［11］于1998年發現了紅曲的另一種生物活性成分——紅曲多糖，對其化學結構進行了初步研究，結果表明，紅曲多糖具有抗腫瘤、提高免疫力等多種功效［12－14］．目前，國內外關于紅曲霉產多糖的研究較少，目前尚未實現工業化生產．針對紅曲多糖液態發酵產量不高的現狀，本文利用已篩選的1株高產紅曲多糖菌種，對紅曲霉搖瓶發酵產多糖進行了條件優化研究，以期為紅曲多糖的工業化生產提供一定的基礎．

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

紅曲霉N(Monascus sp．N)，由天津科技大學食品生物技術研究室保存．

1.2 材料與儀器

1.2.1 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4·3H2O、鉬 酸 銨、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4，均為分析純，天津市北方天醫化學試劑廠;麥芽糖、木糖、糊精，均為分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司;濃硫酸(分析純)，天津市化學試劑三廠;苯酚(分析純)，天津市永大化學試劑有限公司;甘油(分析純)，天津市化學試劑一廠．

1.2.2 主要儀器

T1000型電子天平，常熟雙杰測試儀器廠;LSB50L型立式壓力蒸氣滅菌鍋，上海華線醫用核子儀器有限公司;VS－840－2型潔凈工作臺，上海博迅實業有限公司;HH．BII．600型電熱恒溫培養箱，天津試驗儀器廠;MP－220型酸度計，梅特勒托利多儀器公司;ZHWY－100C型恒溫培養振蕩器，上海保興生物設備工程有限公司;TDL－5－A型離心機，上海安亭科學儀器廠;DK－S26型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司;Aglient 8453型紫外可見分光光度計，Aglient公司．

1.3 培養基

斜面培養基:麥芽汁(10°Bé)，瓊脂 2%，pH 自然，121℃滅菌20 min，制備斜面．

種子培養基:葡萄糖7%，蛋白胨3%，NaNO30.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 自然，121 ℃ 滅菌 20 min．

發酵基礎培養基:蔗糖4%，蛋白胨0.4%，KH2PO4·3H2O 0.3%，MgSO4·7H2O 0.08%，pH 5.0，121 ℃滅菌20 min．

發酵培養基:在發酵基礎培養基中，分別添加40 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、甘油和糊精為碳源，作為碳源種類篩選培養基;對優化后的蔗糖為碳源，以質量濃度 20，25，30，35，40，45，50，55，60 g/L的培養基作為碳源質量濃度優化培養基．在發酵基礎培養基中，分別添加4 g/L的NaNO3、NH4Cl、蛋白胨、酵母粉、NH4NO3和(NH4)2SO4為氮源，作為氮源種類篩選培養基;對優化后的酵母粉為氮源，以質量濃度 2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6 g/L 的培養基作為氮源優化培養基．

1.4 發酵方法

孢子懸浮液的制備:在紅曲霉N試管斜面中加入15 mL無菌水，用無菌小勺輕刮長滿菌絲體的培養基斜面，得到孢子懸浮液．

種子的培養:取紅曲霉N孢子懸浮液10 mL，接種到種子培養基中，1 000 mL三角瓶中裝200 mL種子培養基，在32℃往復式搖床中130 r/min培養24 h．

發酵條件優化:按體積分數為8%接種量，將紅曲霉N種子液接入到發酵基礎培養基中(1 000 mL瓶中裝200 mL發酵培養基)，180 r/min，33℃培養84 h．測定不同培養基組成及不同發酵條件下紅曲多糖的產量．

1)不同碳源發酵培養基的優化:在發酵基礎培養基中，分別添加40 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、甘油和糊精，考察碳源對紅曲霉N多糖產量的影響．

2)不同蔗糖濃度發酵培養基的優化:在前期優化的培養基基礎上，分別添加 20，25，30，35，40，45，50，55，60 g/L質量濃度的蔗糖，考察碳源質量濃度對紅曲霉N多糖產量的影響．

3)不同氮源發酵培養基的優化:在前期優化的培養基基礎上，分別添加4 g/L的NaNO3、NH4Cl、蛋白胨、酵母粉、NH4NO3和(NH4)2SO4，考察氮源對紅曲霉N多糖產量的影響．

4)不同酵母粉濃度發酵培養基的優化:在前期優化的培養基基礎上，分別添加 2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6 g/L質量濃度的酵母粉，考察氮源質量濃度對紅曲霉N多糖產量的影響．

5)不同碳氮摩爾比的優化:培養基中蔗糖質量濃度為45 g/L，含碳濃度為1.578 9 mol/L;酵母粉(ω(N)=9.0%)為4.5 g/L，含氮濃度為0.0289 mol/L，則每升培養基中n(C)∶n(N)為54.6∶1．在前期優化的培養基基礎上，分別選取 34.7∶1，43.7∶1，54.6∶1，68.3∶1，85.8∶1的碳氮摩爾比，考察碳氮摩爾比對紅曲霉N多糖產量的影響．

6)不同礦質元素的優化:在前期優化的培養基基礎上，KH2PO4·3H2O的質量濃度分別選用1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 g/L，MgSO4·7H2O的質量濃度分別選用 0.60，0.65，0.70，0.75，0.80，0.85，0.90，0，95，1.00 g/L，考察礦質元素對紅曲霉N多糖產量的影響．

1.5 測定方法

1.5.1 葡萄糖標準曲線的繪制

采用苯酚－濃硫酸分光光度法［15－17］．吸取0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，分別置于 25 mL 比色管中，補蒸餾水至2.0 mL，各加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后加入濃硫酸5 mL，立即搖勻，置沸水浴中煮沸15 min，冷卻，以試劑空白溶液為參比，1 cm比色皿，用分光光度計在490 nm波長處測定吸光值．以OD490為橫坐標、葡萄糖濃度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，線性回歸求得總糖的曲線方程．將待測液的OD490對照標準曲線方程，計算紅曲霉發酵液的多糖含量．

1.5.2 樣品的測定

紅曲霉發酵液中總糖濃度的測定:苯酚－濃硫酸分光光度法．

紅曲霉發酵液中殘余蔗糖的測定:鉬藍光度法［18］．

具體測定過程:每12 h從搖床中取出一瓶紅曲霉N發酵液，取10 mL發酵液進行抽濾．濾液加蒸餾水定容至10 mL，轉至容積為50 mL的離心管，加

4倍體積95%的工業酒精，搖勻后放冰箱中靜置12 h．4 000 r/min離心10 min，棄上清液后加10 mL蒸餾水溶解沉淀，加0.2 g活性炭，搖勻后靜置6 h去色素．4 000 r/min離心10 min，棄活性炭后得上清液，取0.1～0.5 mL上清液于比色管中(使最終稀釋液吸光值落在0.1～0.9)，以蒸餾水定容至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚溶液搖勻后延管壁緩慢注入濃硫酸5 mL，立即搖勻，置于沸水浴中保溫15 min，冷卻至室溫后于490 nm測OD值，以標準曲線計算總糖含量．樣品中總糖含量計算公式為:

式(1)中:X1為發酵液中總糖含量，單位為mg/L;A1為苯酚－硫酸法測樣品所得OD值;V1為吸取去色素后的上清液的體積，單位為mL．

鉬藍光度法所測殘余蔗糖濃度為X0．

紅曲霉發酵液中積累多糖的濃度計算公式為:

紅曲霉液態發酵菌體量的測定:將測多糖時剩余的發酵液抽濾，得菌體，合并測多糖時抽濾所得菌體，置60℃恒溫烘箱里直至重量不再變化，稱重．

2 結果與分析

2.1 苯酚－硫酸法測總糖標準曲線

回歸得到測總糖的曲線方程(見圖1)為:y=0.0856x+0.0013，R2=0.999 2．說明方程在糖質量濃度為0.01～0.07 g/mL之間的線性關系良好，可根據該公式計算得到紅曲霉N發酵液中的總糖含量．

圖1 葡萄糖標準曲線Fig．1 Standard curve of glucose solution

2.2 紅曲霉產多糖的液態發酵培養基優化

2.2.1 碳源對紅曲霉N多糖產量的影響

紅曲霉能夠利用單糖、雙糖、多糖等多種碳源進行生長代謝．按1.4(1)方法，考察不同碳源對總糖及紅曲霉N多糖產量的影響，考慮到不同碳源定量測定的復雜性，以總糖量作為碳源篩選的指標，結果見圖2．

圖2 碳源對紅曲霉N總糖產量的影響Fig．2 Effects of carbon sources on total sugar yield of Monascus sp．N

由圖2可知，以蔗糖為碳源時，紅曲霉N的總糖產量最高，達830.6 mg/L，同時蔗糖來源廣泛，且價格便宜，可作為較理想的生產用碳源．以下實驗選用蔗糖為分批發酵時的最佳碳源．

碳源質量濃度對產物的產量也有較大的影響．按1.4(2)方法，考察蔗糖不同質量濃度對紅曲霉N多糖產量的影響，分批發酵實驗結果見圖3．

圖3 蔗糖的質量濃度對紅曲霉N多糖產量的影響Fig．3 Effects of the concentration of sucrose on polysaccharide yield of Monascus sp．N

由圖3可知，蔗糖質量濃度的不同對紅曲多糖產量有較大影響，蔗糖質量濃度低于45 g/L時，紅曲多糖產量隨蔗糖質量濃度的增加而增加，最高可達718.4 mg/L，而蔗糖質量濃度高于45 g/L時，不利于紅曲多糖的生產．以下實驗選用45 g/L的蔗糖為分批發酵時的較佳碳源質量濃度．

2.2.2 氮源對紅曲霉N多糖產量的影響

氮源是影響紅曲霉生長代謝的一個重要因素，按1.4(3)方法，考察不同氮源對紅曲霉N多糖產量的影響，結果見圖4．

圖4 氮源對紅曲霉N多糖產量的影響Fig．4 Effects of nitrogen sources on polysaccharide yield of Monascus sp．N

由圖4可知，在上述6種氮源中，酵母粉利于紅曲多糖的產生．因為合適的氮源濃度既可保證菌體的生長代謝，又可避免菌體量過大或過小從而影響多糖的合成，因此有必要考察不同氮源質量濃度對紅曲霉N多糖產量的影響，按1.4(4)方法，實驗結果見圖5．

圖5 酵母粉的質量濃度對紅曲霉N多糖產量的影響Fig．5 Effects of concentration of yeast extract powder on polysaccharide yield of Monascus sp．N

由圖5可知，隨酵母粉質量濃度的增加，紅曲多糖產量逐步上升，當酵母粉質量濃度為4.5 g/L時，紅曲多糖產量達最高為793.6 mg/L．當酵母粉濃度繼續增高，利于菌體的生長但多糖產量卻下降．以下實驗選用4.5 g/L的酵母粉為分批發酵時的較佳氮源質量濃度．

2.2.3 碳氮摩爾比對紅曲霉N多糖產量的影響

碳氮摩爾比對微生物的生長和產物形成常有很大的影響，碳氮摩爾比不當會妨礙菌絲對營養物質的吸收．碳氮摩爾比偏小，會導致菌體生長旺盛，造成菌體提前衰老自溶;碳氮摩爾比偏大，菌體則會生長緩慢，產率下降．不同的真菌對碳源和氮源的要求不同，本實驗在原有碳氮摩爾比基礎上研究碳氮的摩爾比對紅曲多糖發酵的影響．

按1.4(5)方法，考察不同碳氮摩爾比對紅曲霉N多糖產量的影響，結果見表1．

表1 碳氮摩爾比對紅曲霉N多糖產量的影響Tab．1 Effects of ratio of n(C)∶n(N)on polysaccharide yield of Monascus sp．N

由表1 可知，n(C)∶n(N)為 54.6∶1時，紅曲多糖的產量最高達793.5 mg/L．以下實驗選用54.6∶1為分批發酵時的較佳碳氮物質的量比．

2.2.4 礦質元素對紅曲霉N多糖產量的影響

菌體在生長代謝時需一定量的礦質元素，其中P、S、K、Mg 4種礦質元素必須通過外界添加才可達到菌體生長所需濃度．對于這幾種元素來源，首選KH2PO4·3H2O 和 MgSO4·7H2O，它們可以同時提供這4種元素．因此，有必要通過實驗確定KH2PO4·3H2O和MgSO4·7H2O的最宜添加量，按1.4(6)方法，實驗結果見圖6和圖7．

圖6 KH2PO4·3H2O的質量濃度對紅曲霉N多糖產量的影響Fig．6 Effects of concentration of KH2PO4·3H2O on polysaccharide yield of Monascus sp．N

由圖6可知，當KH2PO4·3H2O為3.5 g/L時，紅曲多糖產量達到最高，為 815.4mg/L．MgSO4·7H2O的優化選用3.5 g/L為分批發酵時KH2PO4·3H2O的較佳質量濃度．

由圖7可知，當MgSO4·7H2O為0.85 g/L時，紅曲多糖產量達到最高為829.6 mg/L．以下實驗選用0.85 g/L為分批發酵時MgSO4·7H2O的較佳質量濃度．

圖7 MgSO4·7H2O的質量濃度對紅曲霉N多糖產量的影響Fig．7 Effects of concentration of MgSO4·7H2O on polysaccharide yield of Monascus sp．N

2.3 紅曲霉產多糖的液態發酵工藝條件優化

采用正交試驗方法．以上述優化的培養基成分為基礎，進行了發酵工藝條件的單因素實驗，基于單因素實驗結果，以種齡、接種量、培養基初始pH和裝液量進行L9(34)正交試驗設計．

正交試驗因素與水平設計見表2．

表2 正交試驗設計表Tab．2 Factors and levels of orthogonal design

正交試驗結果與分析見表3．

由表3可知，較優水平為5號組合，即A2B2C3D1;按照極差R的大小確定各因素的主次順序，為A＞C＞B＞D，即種齡＞培養基初始pH＞接種量＞裝液量，種齡對紅曲多糖的產量影響最大，然后是培養基初始pH，其次是接種量，最后是裝液量;根據k值分析得出的較佳組合為A2B2C3D3，未出現在9組試驗中．經驗證，A2B2C3D1組合更優于 A2B2C3D3組合．因此紅曲霉N液態發酵產多糖的優選工藝條件為:種齡30 h，接種量7.5%，發酵培養基初始 pH 5.75，1 000 mL三角瓶裝液量162.5 mL，發酵時間84 h．在此條件下，紅曲霉N搖瓶液態發酵的多糖質量濃度達999.8 mg/L，比優化前的684.2 mg/L高46.1%．

表3 正交試驗結果分析Tab．3 Experiment arranged by orthogonal design and results

3 結論

根據實驗得出紅曲霉N優化后的發酵培養基為:蔗糖 45 g/L、酵母粉 4.5 g/L、KH2PO4·3H2O 3.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.85 g/L．優化后的發酵工藝條件為:種齡30 h，接種量7.5%，發酵培養基初始pH 5.75，1 000 mL三角瓶裝液量162.5 mL，發酵時間84 h．在此條件下，紅曲霉搖瓶液態發酵的多糖質量濃度達999.8 mg/L，比優化前的 684.2 mg/L高46.1%．

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(責任編輯:檀彩蓮)

Optimization of Liquid Fermentation Conditions of Polysaccharide by Monascus sp．

WU Jian-ping， WANG Chang-lu， CHEN Mian-hua， WANG Yu-rong， LI Feng-juan
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education/College of Food and Biology Engineering，Tianjin University of Science＆ Technology，Tianjin 300457，China)

The liquid state fermentation conditions of polysaccharide by Monascus sp．were investigated．The optimized culture medium was as follows，sucrose 45 g/L，yeast extract powder 4.5 g/L，KH2PO4·3H2O 3.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.85 g/L．The fermentation conditions were optimized by single factor experiment and orthogonal test．The optimal fermentation conditions were as follows，seed culture age of 30 h，inoculation volume of 7.5%，initial pH of 5.75，liquid medium volume of 162.5 mL in 1 000 mL conical flask，and the fermentation lasted for 84 h．The highest yield of polysaccharide could be up to 999.8 mg/L，which was 46.1%higher than that of original yield of 684.2 mg/L．

Monascus sp．;polysaccharide;liquid state fermentation;conditional optimization

TS201.2;Q815

A

1671-1513(2012)06-0057-06

2012-02-27

國家自然科學基金資助項目(31171729)．

伍健萍，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術;

王昌祿，男，教授，博士生導師，主要從事食品生物技術方面的研究．通訊作者．