參術膠囊對脾虛胃癌小鼠T細胞活化信號的影響

鄧青秀，彭 成，敖 慧，謝曉芳

(成都中醫藥大學，四川 成都 610075)

參術膠囊處方來源于《證治準繩》中治療脾氣虛證之“參術膏”。實驗研究表明參術膠囊能明顯改善瘤細胞的異型性，并能通過調控與代謝、離子通道和運輸蛋白等相關基因來發揮治療脾虛胃癌轉移鼠［1－2］。機體的免疫功能狀態與脾虛胃癌的發生密切相關。因此，本研究以誘發性脾虛胃癌小鼠為模型，觀察參術膠囊對脾虛胃癌小鼠T細胞活化信號的影響，進一步明確參術膠囊抗腫瘤作用的分子機制和作用靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 免疫組化一抗:MHC-Ⅰ大鼠抗小鼠IgG(英國ABCAM公司，貨號:ab15681)，MHC-Ⅱ大鼠抗小鼠(美國MILLIPORE公司，批號:NRG1810099)，B7-1兔抗大鼠IgG(北京博奧深公司，批號909002W)，CD4兔抗大鼠IgG(北京博奧深公司，批號:900283W)，CD8兔抗大鼠IgG(北京博奧深公司，批號900280W)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號:11888800)，堿磷酶底物AP-Red試劑盒(北京中衫金橋有限公司，批號:P106723C)，顯色劑 DAB(武漢博士德生物工程有限公司，批號:112452Q)。電子天平PA2003(上海天平儀器廠)，Olympus-BX50光學顯微鏡(日本)。

1.2 藥物 參術膠囊(由成都中醫藥大學藥學院提供，由紅參皂苷、白術油、紅參白術復合多糖，每g提取物含10 g原生藥，批號20080401)，胃復春片(杭州胡慶余堂藥業有限公司，0.359克/片，批號:20090712)，山西白醋(山西老陳醋集團有限公司，標準代號:GB18187.2000)，N-亞硝基二乙胺(DENA)(日本TCI公司，批號:BW03821)。

1.3 誘發性脾虛胃癌模型的制備 KM小鼠，♀♂各半，體質量22～26 g，由成都中醫藥大學動物中心提供［SPF級，許可證號SCXK(川)2008-11］。按體重隨機取17只小鼠作為空白組，其余按以下方法造模:禁食24 h后首日給予山西白醋 15 ml·kg－1·d－1，次日給予 10 ml·kg－1·d－1灌胃，連續9 d，d 10給予 N-亞硝基二乙胺(DENA)按2.8 mg·kg－1·d－1灌胃，連續 110 d。

1.4 動物分組和處理 將剩余的227只小鼠隨機分成5組，其中模型組56只，陽性組51只，高劑量組46只，中劑量組34只，低劑量組40只，其中模型組不予處理，陽性組按718 mg·kg－1·d－1灌胃給藥胃復春片，高劑量組按參術膠囊 440 mg·kg－1·d－1，中劑量組按 220 mg·kg－1·d－1，低劑量組按110 mg·kg－1·d－1灌胃給藥，連續30 d。每隔 10 d測量體重、5 min自發活動、觀察脾虛表現(飲水量、自發活動數、精神狀態，有無便溏、腹脹、聳毛、瞇眼等)。治療30 d后稱取小鼠重量，再脫頸椎處死小鼠，取胃于10%福爾馬林固定，石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察胃組織切片的變化。每組隨機取10只動物標本，按免疫組化SABC法操作流程進行，漿或膜呈棕黃色－黃色表達為陽性。采用OlympusBX50顯微鏡，在40×10倍光學顯微鏡下，用泰盟 BI-2000醫學圖像分析系統將免疫組化圖像采集，半定量分析表達情況。每張切片(每例動物標本)隨機選取5個視野，計數陽性(表達)細胞個數，取平均數。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件。計量資料以±s表示，用單因素方差分析法進行組間差異顯著性分析。

2 實驗結果

2.1 一般狀態表現 脾虛胃癌模型組在實驗過程中動物出現不同程度的脾虛表現，小鼠毛色灰暗、失去光澤、形體瘦弱、行動遲緩、精神萎靡不振、攝食量和飲水量減少。用藥30 d后，參術膠囊高、中、低劑量組均能明顯提高模型動物的存活率、體重及5 min自發活動數。

2.2 胃組織病理表現 胃癌模型組組織結構紊亂，呈浸潤性生長，與周圍組織分界不清，癌細胞中等偏大，呈圓形、橢圓形、多邊形及不規則形，胞質較少，核染色較深，呈橢圓形、三角形及不規則形，數呈空泡形，核分裂象較多，核仁粗大，位于核中或偏位，多數具有一個核仁，少數有兩個或者以上染色深。用藥30d后，胃復春片組、參術膠囊高、中、低劑量均能明顯減輕病理改變。

2.3 參術膠囊對誘發性脾虛胃癌模型T細胞活化信號的影響 模型組胃組織表達的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1、CD4、CD8陽性細胞數均低于正常組。胃復春片組和參術膠囊高劑量組均能明顯增加模型動物胃組織 MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1、CD4、CD8的表達(P＜0.05)。參術膠囊低劑量組MHC-Ⅰ、B7-1、CD4、CD8陽性細胞數較模型增加明顯(P＜0.05)，MHC-Ⅱ表達的陽性細胞數較模型有增加趨勢。參術膠囊中劑量組能明顯增加模型動物MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1、CD4的表達(P＜0.01)，CD8表達的陽性細胞數有增加趨勢。

Tab 1Effect of Shenshu capsules on T activation signals of spleen-deficient gastric cancer mice(±s，n=10)

Tab 1Effect of Shenshu capsules on T activation signals of spleen-deficient gastric cancer mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs model

Group Dosage/mg·g－1 Cell counts of MHC-Ⅰpositivity Cell counts of MHC-Ⅱpositivity Cell counts of B7-1 positivity Cell counts of CD4 positivity Cell counts of CD8 positivity Control group － 2.30 ±1.25 2.50 ±1.27 2.80 ±2.20 3.00 ±1.49 2.40 ±0.52 Model group － 0.60 ±0.70* 0.90 ±0.88 0.40 ±0.52 0.20 ±0.63＊＊ 0.70 ±1.16*Weifuchun group 0.718 1.90 ±0.74△ 4.70 ±1.95△△ 3.30 ±1.16△△ 2.40 ±1.43△ 4.10 ±1.29△△Low dosage group 0.110 2.10 ±1.10△ 1.90 ±0.57 3.30 ±1.06△△ 3.30 ±0.82△△ 2.20 ±0.79△Middle dosage group 0.220 12.60 ±6.42△△ 6.20 ±1.55△△ 3.90 ±0.74△△ 8.10 ±3.98△△ 1.80 ±0.42 High dosage group 0.440 4.40 ±1.43△△ 6.30 ±1.34△△ 3.20 ±1.48△△ 6.20 ±3.49△△ 4.40 ±1.51△△

3 討論

細胞表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子的弱表達與丟失，導致免疫細胞的應答無能是導致腫瘤細胞逃逸機體免疫監視和逃逸特異性CTL抗腫瘤免疫應答的重要機制［3－4］。中藥藥理研究結果發現，許多中藥在調節機體免疫功能方面獨具優勢［5－8］。本研究發現，脾虛胃癌模型胃組織內 CD4、CD8、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1 表達下調，T 細胞活化信號減弱，使T細胞處于無能狀態，導致腫瘤細胞逃避免疫監視。經參術膠囊治療后，能明顯改善胃組織的病理變化，上調胃組織內 CD4、CD8、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1 的表達。說明參術膠囊是通過增強T細胞活化雙信號T細胞受體(TCR)與抗原肽—MHC復合物和共刺激分子B7-1的表達，使T細胞活化的信號轉導借助于CD3分子及CD4/CD8分子和CD28等分子的輔助，將胞外刺激信號傳遞至細胞內部，使轉錄因子活化，轉位到核內，活化相關基因。

CD8+T細胞的激活不同于CD4+T細胞的激活。CD8+T細胞作用的靶細胞一般低表達或不表達協同刺激分子，不能有效激活初始CD8+T細胞，而需要CD4+T細胞產生的IL-2等細胞因子的輔助增殖，才能分化為CD8+T細胞，本研究發現參術膠囊有可能通過增強CD4+T的表達，進而增強CD8+T細胞的活性，并通過細胞凋亡和細胞裂解機制殺傷腫瘤細胞，抑制脾虛胃癌的發生發展。

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