氫化可的松對酮康唑經大鼠皮膚透過性的影響

蘇碧雅，李國鋒，熊璐琪，趙博欣

(南方醫科大學南方醫院藥學部，廣東廣州 510515)

糖皮質激素類藥物能有效防治皮膚炎癥［1］，但是糖皮質激素的濫用問題已經引起廣泛關注，長期使用會引起皮膚組織學的變化，皮膚變薄是長期用藥產生的副反應之一［2］，皮膚細胞培養實驗中，在培養基中加入糖皮質激素14 d后，可引起表皮層細胞減少，同時觀察到皮膚萎縮，皮膚表皮層變薄，角質細胞增殖受到抑制，真皮層膠原蛋白合成量減少［3］。目前受到廣泛關注的是糖皮質激素長期使用后引起皮膚改變及其機制，尚未見糖皮質激素經皮給藥后引起的組織學改變對其他藥物經皮透過影響方面的研究，未見關于糖皮質激素類藥物和其他經皮給藥制劑聯合使用時相互作用的研究。本文選擇了氫化可的松這種代表性的糖皮質激素進行了這方面的研究。

1978年口服酮康唑片劑應用于臨床，1981年2%酮康唑乳膏上市［4］。酮康唑具有廣泛的藥理學作用，有多種適應證，但酮康唑具有明顯的肝臟毒性［5］，口服給藥后肝臟毒性明顯，所以局部體表真菌感染一般會選擇外用酮康唑。因此，本文在評價正常皮膚和使用氫化可的松皮膚兩周后大鼠皮膚透過性差異實驗中，選擇了酮康唑這種常用的抗真菌藥物作為評價藥物。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 日本島津LC-20A高效液相色譜儀，SPD-20AT檢測器;TK-20A型藥物透皮擴散試驗儀(上海鍇凱科技貿易有限公司);Thermo Scientific Sorvall Legend Mach 1.6/R臺式離心機(上海托莫斯科學儀器有限公司);PB110S電子天平(德國Sartorins公司);HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);松下電動剃毛刀等。

1.2 試劑 酮康唑對照品(中檢所，批號100294-200602)，酮康唑原料藥(純度≥99%，廣州越迪化工有限公司分裝)，氫化可的松對照品(Sigma公司)，氫化可的松原料藥 (純度≥99.3%，深圳市益飛商貿有限公司)。高效液相試劑甲醇為色譜純，水為雙蒸去離子水，乳膏基質輔料等其他試劑均為分析純。

1.3 動物 正常SPF級♂ Wistar大鼠，體質量(250±10)g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(粵)2006-0015。實驗期間給予普通飼料和清潔飲水。

2 方法

2.1 氫化可的松乳膏劑的配制(1%含藥量) 處方:氫化可的松原料藥10 g，硬脂酸100 g，單硬脂酸甘油酯50 g，液體石蠟140 ml，白凡士林50 g，甘油50 g，十二烷基硫酸鈉(SDS)1 g，三乙醇胺3.5 g，蒸餾水616 ml。配制步驟:將上述藥物水相和油相分別加熱至80℃(水相溫度略高于油相)，將水相緩緩加入油相中，按同一方向隨加隨攪拌，繼續攪拌冷卻至60℃左右時，將此混合液逐步加入到氫化可的松的甘油糊狀物中，仍按同一方向隨加隨攪拌，冷凝后停止攪拌，即得，共制成1 000 g。

2.2 動物實驗 12只Wistar♂大鼠，體質量(250±10)g，隨機分為2組，每組6只，分別為對照組(Control group)和氫化可的松組(HC group)。大鼠固定后，用剃須刀將腹部毛剃除干凈，兩組分別涂空白乳膏或氫化可的松乳膏(劑量為2 g·d-1)，給藥面積約6 cm2(2 cm×3 cm)，涂藥后大鼠仰躺固定以防大鼠舔食乳膏，2 h后用脫脂棉蘸生理鹽水除去腹部殘留乳膏，清潔腹部皮膚，放回鼠籠，每天給藥1次，連續給藥2周。

2.3 酮康唑經氫化可的松組和空白乳膏組大鼠皮膚體外透皮實驗

2.3.1 酮康唑乳膏的制備(2%含藥量) 處方:酮康唑原料藥20 g，硬脂酸100 g，單硬脂酸甘油酯50 g，液體石蠟 140 ml，白凡士林 50 g，甘油 50 g，十二烷基硫酸鈉(SDS)1 g，三乙醇胺3.5 g，蒸餾水616 ml。配制步驟:將上述藥物水相和油相分別加熱至80℃(水相溫度略高于油相)，將水相緩緩加入油相中，按同一方向隨加隨攪拌，繼續攪拌冷卻至60℃左右時，將此混合液逐步加入到酮康唑的甘油糊狀物中，仍按同一方向隨加隨攪拌，冷凝時停止攪拌，即得，共制成1 000 g。

2.3.2 體外Franz實驗 取給藥2周后的大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(劑量30 mg·kg-1)，用脫脂棉沾生理鹽水擦干凈皮膚，取下鼠皮，放血處死動物。小心的用沾有生理鹽水的脫脂棉除去皮下脂肪待用。取已處理好的大鼠腹部皮膚固定在擴散池中，透皮擴散有效內徑為1.8 cm，接收室體積為6.5 ml，接收液為10%乙醇PBS(pH 7.4)。整個實驗過程(37.0±0.2)℃水浴，300 r·min-1攪拌。分別稱取酮康唑乳膏或空白乳膏(空白乳膏透過液用于方法學專屬性考察和酮康唑標準曲線的配制)2 g加于供應室中，供應室上用保鮮膜封口，防止水分蒸發。分別于 0.5、1、2、4、6、8、12 和 24 h 取樣 0.5 ml，同時補充相同體積相同溫度的新鮮接收液。樣品離心10 min(15 000 r·min-1)，取上清液注入HPLC測定酮康唑的濃度。

2.4 酮康唑HPLC檢測方法的建立

2.4.1 色譜條件 選用 ECOSIL C18色譜柱(5 μm，250×4.6 mmI.D.)，流動相為甲醇 -0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(70∶30)(水相用0.01 mol·L-1的NaOH溶液調節pH到6.8)，流速:1.0 ml·min-1，紫外檢測波長235 nm，柱溫35℃。

2.4.2 酮康唑對照品儲備液配制 精密稱定酮康唑標準品20 mg，置100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得質量濃度為200 mg·L-1的酮康唑甲醇儲備液。

2.4.3 標準曲線繪制 將酮康唑對照品儲備液逐一稀釋(稀釋溶劑為氫化可的松組皮膚給空白乳膏后的Franz透過液)，得質量濃度分別為12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg·L-1的標準品溶液，注入HPLC測定峰面積，得到標準曲線。

2.4.4 精密度試驗 取12.5、3.13、0.10 mg·L-13個不同濃度的酮康唑標準品，每日重復測定3次，記錄峰面積，連續3 d，計算日內精密度和日間精密度。

2.4.5 加樣回收率實驗 精密稱取酮康唑細粉適量，按低、中、高3個標準加入到已知濃度的酮康唑標準品溶液中，超聲5 min溶解后定容，過濾。測樣品中酮康唑濃度，計算加樣回收率，加樣量見Tab 1。

2.5 酮康唑穩定性實驗 酮康唑具有酰胺基和醚基結構，容易氧化變質［6］，因此本實驗做了穩定性研究。

2.5.1 氫化可的松用藥后的皮膚對酮康唑穩定性的影響 取使用氫化可的松給藥2周后的大鼠腹部皮膚3份，每份約6 cm2，分別加生理鹽水多次研磨制成組織懸液，15 000 r·min-1離心15 min后取上清液，以該上清液為溶劑，配制12.5、3.13、0.10 mg·L-13個不同濃度的酮康唑溶液，每個濃度用不同皮膚懸液配3份，共9份，配制后0.5、12、24 h分別做HPLC檢測，計算配制濃度和實測濃度的差異性。

2.5.2 酮康唑標準品穩定性研究 取12.5、3.13、0.10 mg·L-13個不同濃度的酮康唑標準品溶液分別于配制后第 0、2、4、6、8、12 和 24 h 測定酮康唑峰面積，計算RSD。

2.6 自制乳膏劑藥物含量的測定

2.6.1 氫化可的松乳膏供試液的制備 精密稱取氫化可的松乳膏2 g(相當于氫化可的松20 mg)，置燒杯中，加甲醇約30 ml，在水浴上加熱使溶解，再置冰水中冷卻，濾過，濾液置100 ml容量瓶中，如此提取3次，濾液并入量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心后注入液相色譜儀檢測［7］。按上述方法配制3份樣品，計算含量平均值和RSD。

2.6.2 酮康唑乳膏供試液的制備 酮康唑乳膏提取方法參照“2.6.1”，按上述方法配制3份樣品，計算平均值和RSD。

2.7 統計學處理 實驗結果采用SPSS 13.0軟件進行統計。計量資料結果用±s表示。正常組與HC組大鼠皮膚滲透速率比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-Sample T Test，2-tailed)。

3 結果

3.1 HPLC方法學考察

3.1.1 專屬性 分別取空白乳膏皮膚透過液、酮康唑對照品溶液和8 h酮康唑乳膏皮膚透過液做HPLC檢測，可見酮康唑保留時間約為9.5 min，分離良好(Fig 1)。

Fig 1 HPLC chromatograms of ketoconazole

3.1.2 線性范圍 測定質量濃度分別為12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg·L-1酮康唑溶液的峰面積，所得標準曲線回歸方程為Y=3e-5X-0.3102(r2=0.9999)，線性范圍為0.05～12.5 mg·L-1，線性良好。

3.1.3 精密度 取12.5、3.13、0.10 mg·L-13個不同濃度的酮康唑標準品溶液，每日重復測定3次，記錄峰面積，連續3 d，計算得日內精密度和日間精密度的RSD均＜3.5%。

3.1.4 加樣回收率實驗 精密稱取酮康唑細粉適量，按低、中、高3個標準加入到已知濃度的酮康唑溶液中，超聲5 min溶解后用定容至刻度，過濾，做HPLC檢測，結果見Tab 1。

Tab 1 The average recovery of ketoconazole(n=9)

3.2 酮康唑穩定性實驗結果

3.2.1 氫化可的松用藥后的皮膚對酮康唑穩定性的影響 計算得，9份樣品(實測濃度/配制濃度)×100%的范圍在95% ～105%之間，RSD＜4.684%，這說明給藥后皮膚中殘留的氫化可的松和乳膏劑基質對酮康唑HPLC檢測的干擾不影響檢測。

3.2.2 酮康唑標準品穩定性研究 取12.5、3.13、0.10 mg·L-13個不同濃度的酮康唑標準品溶液分別于配制后第 0、2、4、6、8、12 和 24 h 測定酮康唑峰面積，計算所得RSD均＜1.56%，表明供試品溶液在室溫下穩定性良好。

3.3 自制氫化可的松乳膏和酮康唑乳膏質量檢查結果

3.3.1 主藥含量測定 自制氫化可的松乳膏劑中氫化可的松的平均含藥量為0.92%，RSD為0.7%，自制酮康唑平均含藥量為2.01%，RSD為3.2%。均符合藥典規定的90%～110%標示量區間。

3.3.2 乳膏劑穩定性評價 稱取1 g乳膏加2 ml水5 000 r·min-1離心10 min后無分層現象。乳膏置于4℃保存1個月后沒有出現酸敗和異味。

3.4 Franz實驗結果 測得的樣品藥物濃度按下列公式計算單位面積的累計透過量(permeated A-mount quantity，Q)

方程式中V:接受池的體積;Cn:第n個取樣點測得藥物的濃度;A:有效擴散面積(本實驗中為2.5434 cm2);Ci:第i(i≤n-1)個取樣點測得的藥物濃度。對各個時間點累計藥物透過量進行線性回歸，得回歸方程，其斜率即為藥物滲透速率(penetrating rate，PR，μg·h-1·cm-2)(Tab 2，Fig 2)。空白乳膏組的滲透速率約為氫化可的松組的兩倍，兩組滲透速率差異有顯著性(P＜0.01)。

Tab 2 The PR of ketoconazole through different group rats’skin(±s，n=6)

Tab 2 The PR of ketoconazole through different group rats’skin(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group PR/μg·cm-2·h -1 Control 0.730±0.042 HC 0.403±0.026＊＊

4 討論

在給藥實驗中，需要設置空白乳膏對照組，因此借鑒了文獻中的處方，選用了自制HC乳膏劑，而非市售制劑，便于制作空白乳膏設立對照組進行比較。在體外透過實驗中，需要建立皮膚透過液中酮康唑的HPLC檢測方法，做專屬性考察，故依據有關資料，自擬了配方，也選用了酮康唑自制乳膏，便于做空白對照。經質量考察發現自制乳膏質量合格，完全滿足實驗需要。

糖皮質激素類藥物的副作用是經皮給藥制劑研究中很受關注的一部分，很多研究者也從各方面證實了糖皮質激素類藥物的各種不良反應及其產生機制，而較少關注糖皮質激素類藥物引起的皮膚改變對合用藥物(或皮質激素給藥后使用藥物)經皮透過的影響。

Fig 2 The ketoconazole permeated amount(Q)-time curve chart

本文初步證實糖皮質激素氫化可的松引起的皮膚改變會導致酮康唑經皮透過量減少、滲透速率降低。查閱文獻表明為國內外首次報道。一般認為，長期使用糖皮質激素后，其引起的皮膚變薄、脂肪萎縮可能造成透過量的增加，但我們發現了與預測相反的結果，有必要進一步進行體內實驗(如腹部給藥后取血檢測藥動學參數，以及在體微透析實驗等)來驗證這種結果，以及通過細胞培養實驗來分析可能的機制等，有關工作我們正在進行中。

選用常用的抗真菌藥酮康唑乳膏作為實驗制劑，得到了有差異的結論，這說明糖皮質激素類藥物經皮給藥一段時間引起的皮膚組織學改變確實能影響其他藥物的經皮滲透和吸收過程。但本實驗只采用了酮康唑作為實驗藥物進行了考察，糖皮質激素類藥物經皮給藥后引起的皮膚組織學改變對其他經皮給藥制劑透過性的影響有待選定更多實驗制劑后做進一步考察，以證實這種影響是否具有普遍性。

連續使用氫化可的松乳膏2周后引起的皮膚改變會導致酮康唑經皮透過量的減少，滲透速率降低。患者在長期使用氫化可的松乳膏后再使用酮康唑經皮給藥制劑時可能需考慮調整劑量，以保證藥物療效。

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