5-羥色胺1A受體激動劑高通量篩選模型的建立

孫 穎，蔡海燕，沈敬山，朱維良，王賀瑤，郭敏亮

(1.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州 225009;2.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203)

抑郁癥目前已成為世界第4大疾患，到2020年可能成為僅次于心臟病的第2大疾?。?］。研究表明，抑郁癥主要是由于生活壓力、基因遺傳和一些易感因素所導致的［2］。國內外報道抑郁癥患者中50% ～85%可反復發作，每年有15%的抑郁癥患者自殺［3］，因此抑郁癥正成為全球公共健康中的一大主要問題。

5-HT1A受體是5-HT受體家族中第1個被克隆出來的亞型。人類遺傳學和圖像學研究表明5-HT1A受體與焦慮癥、抑郁癥、精神分裂癥等一系列精神疾病有關，目前臨床研究表明，其激動劑能有效改善抑郁癥和焦慮癥［4］。因此，開發和尋找5-HT1A受體的激動劑具有重要意義，而構建穩定表達人源5-HT1A受體是該受體激動劑篩選的重要方法和手段。

由于5-HT1A受體在胞內可以調節不同的信號通路，針對5-HT1A受體建立穩定細胞株的方法中目前主要有胞內鈣信號和cAMP水平的測定［5］。本研究采用化學發光的方法測定胞內cAMP的水平以建立可用于高通量篩選5-HT1A受體激動劑的細胞模型。通過對模型建立過程中工具細胞、共轉染質粒比例及化合物孵育時間等方面進行優化，確定模型建立的最佳條件。同時，為了驗證化合物在穩定細胞株上的表現活性，實驗針對幾種經典的5-HT1A受體激動劑展開了相應的研究。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 質粒抽提試劑盒(QIAGEN公司);pcDNA3.1-h5-HT1A受體質粒和pcDNA3.1-pCRE-luc質粒(Stratagene公司);Fugene HD轉染試劑(Roche公司);8-OH-DPAT(Tocris公司);Forskolin(Sigma公司);Steady-glo(Promega公司)。

1.2 主要儀器 Flex Station 3酶標儀(Molecular Devices公司);凝膠成像系統(上海天能科技有限公司);電泳設備(上海天能科技有限公司);冷凍離心機(Eppendorf公司);倒置顯微鏡(Olympus公司);二氧化碳培養箱(Thermo公司)。

1.3 細胞和細胞培養 人胚腎細胞HEK293和中國倉鼠卵巢細胞CHO-K1分別用含10%的胎牛血清(Fatal bovine serum，FBS)的H-DMEM培養基和F12培養基，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱培養。

1.4 常規分子生物學方法 感受態細胞制備、質粒轉化、質粒擴增和瓊脂糖凝膠電泳等常規分子生物學方法參考分子克隆實驗指南，第2版(科學出版社，1998)。質粒的抽提制備方法參考QIAGEN公司生產的試劑盒操作流程。

1.5 穩定表達人源5-HT1A受體細胞模型建立方法 實驗采用熒光素酶報告基因活性檢測方法，將HEK293細胞以2.5×108cells·L－1(每皿4 ml培養基)的密度接種于6 cm培養皿中，37℃、5%CO2條件下培養，當細胞匯合率達到50% ～70%時，pcDNA3.1-h5-HT1A質粒與 pcDNA3.1-pCRE-luc質粒共轉染到細胞中繼續培養24 h后，將細胞以不同比例稀釋到10 cm培養皿中，24 h后加入G418進行篩選，每3天換液，培養基含有G418抗生素，2周后用濾紙片法挑選單克隆，用陽性化合物進行活性驗證，根據信號值和信噪比的大小，選擇陽性克隆擴大培養，連續傳代，并檢測活性，觀察各代信號值和信噪比，挑選穩定的克隆培養，用于實驗研究。

1.6 活性檢測方法 細胞接種于96孔板培養24 h，加入5 μmol·L－1Forskolin孵育30 min，然后加入不同濃度的陽性化合物，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱繼續孵育6 h后，用Steady-glo試劑盒在Flex Station 3酶標儀上檢測熒光信號強度。

1.7 統計學處理 實驗數據使用GraphPad Prism 5軟件處理，劑量依賴曲線通過非線性回歸分析中Dose-response-Inhibition的公式擬合而成，進而計算IC50。

2 結果

5-HT1A受體在細胞中主要有cAMP信號通路和磷脂酰肌醇信號通路，前者受體下游偶聯Gi蛋白，影響cAMP水平;后者受體偶聯Gq蛋白，引起胞內外鈣流變化，可采用檢測胞內鈣離子濃度的方法［6］。本實驗采用化學發光的方法檢測胞內cAMP，從而檢測受體的活性狀態。

2.1 工具細胞的選擇 建立穩定表達5-HT1A受體的細胞株首先應選擇合適的工具細胞。實驗室常用的工具細胞有CHO-K1和HEK293。本實驗以檢測到的化學發光信號強度和靈敏度為指標對兩種細胞進行比較和選擇。將細胞接種于96孔板中，并對接種密度進行了摸索，CHO-K1細胞接種密度為20 000個/孔，HEK 293細胞接種密度為25 000個/孔(每孔100 μl)。Fig 1顯示，A組為質粒瞬轉CHO-K1細胞，B組為質粒瞬轉HEK 293細胞;與A組相比，B組加陽性激動劑APD356刺激后信噪比較高，因此，在本實驗中選擇HEK 293細胞作為工具細胞來建立穩轉細胞株。

Fig 1 Effect of APD356 acting on two different cells

2.2 質粒共轉比例摸索與克隆挑選 為了獲得更高的信噪比和靈敏度，實驗對h5-HT1A受體質粒和報告基因pCRE-luc質粒共轉比例進行了探索。實驗設5組轉染比例，pcDNA3.1-h5-HT1AR:pcDNA3.1-pCRE-luc分別為 1 ∶1，1 ∶2，1 ∶3，1 ∶4，1 ∶5，結果表明，在陽性激動劑 APD356的刺激下，各組轉染比例結果相近，但相對而言，當pcDNA3.1-h5-HT1AR:pcDNA3.1-pCRE-luc比例為1∶3時化合物作用后信噪比最好，為3倍左右，而其他比例為2倍左右(Fig 2)。因此在后面的研究中選擇兩者的轉染比例為1∶3。按上述轉染比例進行穩轉，挑選到了4個較好的克隆(Fig 3)，其中8號和24號信噪比較高，有4～5倍，從而進行擴大培養，而8號克隆在連續傳代培養過程中信號逐漸降低，24號克隆信號穩定，因此本實驗選擇24號克隆進行下一步的研究。

Fig 2 Effect of different plasmid ratios(±s，n=3)

Fig 3Activity of four stable line cells(±s，n=3)

2.3 化合物孵育時間的摸索 由于胞內cAMP的水平調控下游報告基因pCRE-luc的表達，而后者的蛋白質表達水平因時間而變化，因此，為了得到最優檢測結果，實驗選取了1～7 h的化合物孵育時間進行信號強度檢測和比較。具體的細胞轉染以及檢測過程見實驗方法，陽性化合物為25 μmol·L－1的APD356。實驗結果表明化合物孵育時間在1～5 h隨時間越長作用效果越明顯，而信號值在5～7 h內穩定，因此本實驗選擇最佳孵育時間為6 h(Fig 4)。

2.4 不同激動劑對信號的影響 cAMP信號通路中，5-HT1A受體下游偶聯Gi蛋白，在激動劑作用下，胞內cAMP水平降低。而在本實驗的體系中，胞內cAMP水平通過報告基因的表達水平得以體現，即當激動劑作用于受體時，報告基因luciferase的表達下降。實驗選取了4種經典的5-HT1A受體激動劑進行研究。

Fig 4 Effect of APD356 with different incubation time

2.4.1 5-HT.HCl5-羥色胺俗稱血清素，既是一種重要的神經遞質，又是一種血管活性物質，它為5-HT受體的內源性配體。5-HT1A受體偶聯Gi蛋白，理論上與其激動劑結合后使cAMP水平降低，但選擇5-HT.HCl為陽性藥時空白組(加Forskolin)數值較加藥組低，即加藥組cAMP水平卻升高，Fig 5顯示 EC50為(532.5 ±1.8)nmol·L－1，與理論推測結果相反，這一結果可能是由于工具細胞HEK 293上存在內源型5-HT受體的其它亞型，這些亞型在5-HT.HCl的刺激下可以升高胞內cAMP水平，而這些亞型對cAMP水平的影響大于5-HT1A受體，因此，最終綜合的胞內cAMP水平表現為升高。

Fig 5 Activity of agonist 5-HT.HCl(±s，n=3)

2.4.2 Flibanserin Flibanserin 為 5-HT1A受體的選擇性激動劑，同時是5-HT2A受體的拮抗劑，實驗結果表明空白組(加Forskolin)數值較加藥組高，而加入不同濃度的化合物于細胞中卻發現細胞有不同程度的損傷(Fig 6)，因此Flibanserin可能對HEK 293細胞具有毒性。為了驗證這一作用，用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)，檢測了Flibanserin對HEK 293細胞活力的影響。結果顯示Flibanserin濃度大于10 μmol·L－1時抑制了HEK 293細胞的生長(Fig 7)，而其它幾個陽性化合物并沒有明顯的細胞毒性。因此這個陽性化合物不適合用于以HEK 293細胞作為工具細胞的5-HT1A受體穩定細胞株。

Fig 6Activity of agonist Flibanserin(±s，n=3)

Fig 7Absorbance value of different agonists(±s，n=3)

2.4.3 Lorcaserin(APD356)據文獻報道，Lorcaserin(APD356)是5-HT2C受體的激動劑［7］，同時 APD356也是5-HT1A受體、5-HT6受體和5-HT7受體的激動劑，它對3者的活性值 Ki值分別為:0.7、2 和 0.64 μmol·L－1［8］。根據文獻調研，HEK293細胞上并不存在內源型表達的5-HT2C受體和5-HT1A受體，而內源型表達的5-HT6受體和5-HT7受體偶聯Gs蛋白，能使cAMP水平升高［9］。實驗結果表明陽性化合物APD356作用于HEK-293-h5-HT1A受體細胞，在Forskolin存在下，劑量依賴性的降低 cAMP信號，IC50為(6.6±1.5)μmol·L－1(Fig 8)。因此，APD356 主要在 5-HT1A受體上發揮了作用，同時也說明了外源轉入的5-HT1A受體水平遠高于5-HT6受體和5-HT7受體。因此，在該體系中APD356可作為陽性化合物。

2.4.4 8-OH-DPAT 8-OH-DPAT 為 5-HT1A受體的激動劑，文獻報道，在Forskolin或其他物質刺激下，5-HT1A受體激動劑在不同細胞中，cAMP變化水平不同［10－11］。本實驗以HEK 293細胞作為工具細胞建立的細胞株上發現在Forskolin刺激的情況下，8-OH-DPAT并沒有明顯的激動作用(Fig 9);而在無Forskolin刺激的情況下，8-OH-DPAT能劑量依賴性地增加本底cAMP的水平(Fig 10)，與5-HT1A受體偶聯Gi蛋白，受激動后會降低胞內cAMP水平這一機制現象相反。同時，以CHO-K1為工具細胞重復了這一實驗，卻發現并無此現象，因此推測這一現象與細胞本身有關。研究者發現8-OH-DPAT同時也是5-HT7受體的中等強度的激動劑，而HEK 293細胞內源表達的5-HT7受體偶聯Gs蛋白，與配體結合后，增加本底cAMP水平，與對5-HT1A受體的作用相反。然而在上面實驗中我們推斷外源轉入的5-HT1A受體表達水平遠高于5-HT7受體，因此，8-OH-DPAT在 HEK 293-h5-HT1A受體細胞中的作用可能還存在其他機制。

Fig 8Activity of agonist APD356(±s，n=3)

Fig 9Activity of agonist 8-OH-DPAT(±s，n=3)

總結以上結果，在建立穩轉細胞株時為了排除工具細胞內源表達的蛋白帶來的干擾，需要選擇合適的陽性化合物進行驗證。在本實驗中建立的HEK293-h5-HT1A受體細胞株可選用APD356可作為陽性化合物。

2.5 穩定細胞株的建立和化合物篩選 綜合以上優化條件，建立了穩定表達5-HT1A受體細胞株(HEK293-h5-HT1AR)，該細胞株連續傳代12代，信號值和信噪比較穩定。Fig 11顯示了激動劑APD356對5-HT1A受體的激動作用。利用該穩定細胞模型，對實驗室的60多個化合物進行了篩選，并對活性化合物在只轉染pcDNA3.1-pCRE-luc質粒的HEK293空細胞上進行了驗證，結果顯示化合物96H在HEK293-h5-HT1AR細胞株上顯示對5-HT1A受體有激動效應，IC50為(4.3 ±1.5)μmol·L－1，而在無受體轉染的空細胞上沒有明顯作用(Fig 12)，初步判定該化合物可能是5-HT1A受體激動劑。

Fig 10 Activity of agonist 8-OH-DPAT without Forskolin(±s，n=3)

Fig 11 Activity of APD356 in different generations of stable line cells(±s，n=3)

Fig 12 Activity of compound 96H

3 討論

抑郁癥已成為是一種因腦生化改變所致的疾病，臨床表現為情緒低落、悲觀、睡眠障礙，嚴重者有自傷和自殺沖動。中樞去甲腎上腺素、5-羥色胺、多巴胺等單胺類神經遞質含量過低及其受體功能低下等都被認為是引起抑郁癥的原因［12］?？挂钟羲幨悄壳爸委熞钟舭Y最常規的處方藥。用于抑郁癥治療的藥物主要有3類:(1)三環類抗抑郁藥(TCA);(2)單胺氧化酶抑制劑(MAOI);(3)選擇性5-HT再攝取抑制劑(SSRI)［12］。但是這3類藥物都有各自的不足之處，因此開發研究新型抗抑郁藥迫在眉睫。

動物水平研究發現，5-HT1A受體調節抑郁和焦慮行為，其受體敲除(KO)的小鼠模型在整個生命周期中都表現出焦慮和抑郁現象［13］。5-HT1A受體是一個重要的靶標，它在精神疾病如抑郁癥焦慮癥的治療過程中發揮著重要作用。5-HT1A受體與激動劑結合后，可以降低精神紊亂現象，因此，5-HT1A受體激動劑的研究具有重大開發價值。

在新藥研發過程中，構建高通量篩選模型對新藥的發現起著至關重要的作用，它直接影響著藥物研發的速率［14］。對于5-HT1A受體，由于其在胞內可以調節不同的信號通路，針對5-HT1A受體建立穩定細胞株的方法中目前主要有胞內鈣信號和cAMP的測定。在cAMP信號通路中，5-HT1A受體下游偶聯Gi蛋白，激動劑與受體結合后能降低胞內cAMP水平，從而降低報告基因pCRE-luc的表達?；谶@一原理，本實驗通過化學發光的方法建立了穩定表達5-HT1A受體的細胞株，同時對篩選體系進行了優化。首先，根據檢測得到的信號值和靈敏度確定了工具細胞類型和質粒轉染比例;其次，由于在cAMP的刺激下報告基因pCRE-luc的表達量受時間的影響，實驗比較了化合物不同的孵育時間對信號的影響，選擇了最優化合物孵育時間為6 h;最后，在此次實驗中發現，陽性化合物的選擇至關重要，一方面要考慮該陽性化合物對于細胞的毒性，例如本實驗中選擇性激動劑Flibanserin，它對HEK-293具有細胞毒性，不適合作為陽性對照;另一方面還要考慮該化合物是否是該細胞其它內源型受體的配體以及其他因素的干擾，例如5-HT1A受體的激動劑8-OH-DPAT，在實驗過程中發現并沒有出現預想的實驗現象，其原因可能是受內源表達5-HT7受體和其他因素的影響，顯然該化合物不適用于在該體系中作為陽性化合物?？偨Y以上各種因素，實驗確定了最佳條件:選擇HEK-293為工具細胞，5-HT1A受體和pCRE-luc質粒的轉染比例為1∶3，而化合物的孵育時間選擇6 h，陽性化合物選擇APD356。

本研究表明在建立穩定株的過程中工具細胞的選擇和陽性對照的選擇相當重要，通過上述實驗，我們成功地建立了一個穩定表達5-HT1A受體的細胞株并且確定了篩選平臺的最佳條件。該穩定細胞株經多次傳代驗證該模型信號穩定，可用于高通量篩選。同時，基于這一模型，我們篩選了60多個化合物發現了一個5-HT1A受體激動劑，因此本研究對5-HT1A受體激動劑的發現和研究具有重要的參考意義。

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