絲裂霉素C-聚乳酸凝膠兔氣管外壁給藥后體內釋放量的測定

湯 瑤，孫 旭，李 響，彭莉莉，李進讓，張雙慶，聞 鎳，于 敏，李佐剛，李 波

(1.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監測中心，北京 100176;

2.吉林大學生命科學學院，吉林長春 130012;3.中國人民解放軍海軍總醫院，北京 100048)

聚乳酸(PLA)是近年來臨床實驗中最常用的合成高分子聚合物［1－2］，已通過FDA批準。對于可降解植入劑的載體材料，PLA具備良好的生物相容性，對機體無毒性和無刺激性，對組織、血液、免疫等系統不產生副作用，聚乳酸在體內經非酶性酯鍵隨機水解生成低聚物，最終轉變為CO2和H2O排出體外，為體內正常的代謝產物。PLA的不對稱碳鏈為非規整結構，有利于藥物均勻分布于基質中，適用于藥物釋放系統［3－4］。

絲裂霉素 C(mitomycin C，MMC)是一種非特異性抗腫瘤抗生素，對多種實體瘤有效。MMC主要經靜脈途徑給藥，全身化療，對腫瘤細胞和正常細胞無特異性識別，具有骨髓抑制、胃腸道反應及肝腎功能障礙等毒副作用［5－7］。我們將MMC與PLA制成載藥溫敏型凝膠，藥物以受控的方式從載體中釋放，然后在局部組織上發揮藥效作用，具有良好靶向性、保持藥物活性、提高透膜能力、提高生物利用度，降低其毒副作用，提高療效。

國外已有關于絲裂霉素C在動物和人體內的測定方法及藥代動力學的研究報道［8－13］，國內對MMC在生物基質中的液質聯用方法報道較少。隨著液質聯用技術在體內藥物分析領域中的大量應用［14－15］，本研究采用超高效液相色譜－三重四極桿串聯質譜(UHPLC-MS/MS)聯用技術［16］，建立簡便快捷、靈敏專屬的體內藥物分析方法，研究絲裂霉素C-聚乳酸凝膠兔氣管外壁給藥后體內藥物釋放量，為絲裂霉素C的臨床前藥代動力學研究提供方法學支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 Thermo Accela-TSQ Quantum Access超高效液相色譜－三重四極桿串聯質譜儀(美國Thermo Fisher公司)，配有電噴霧離子源(ESI)和Xcalibur 2.0.7色譜工作站;LABCONCO CentriVap臺式冷凍離心濃縮儀(美國 LABCONCO公司);NEVAP112氮吹儀和OA-SYS加熱系統(美國Organomation Associoates公司);Mettler-Toledo AX205電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司);Advantec PWU-400型超純水儀(日本Advantec公司);Eppendorf Centrifuge 5415R高速臺式離心機(德國Eppendorf公司);Votex Genie-2渦旋儀(美國Scientific Industries公司)。

1.2 藥品與試劑 絲裂霉素 C(Roche107409，純度98%，購自羅氏公司)，曲安奈德(批號:100055-200302，純度＞98%，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇(色譜純，Fisher Scientific公司)，甲酸(色譜純，批號CDK4581，Wako公司)，水為自制超純水，其余試劑均為分析純。兔空白血漿為海軍總醫院采血制備，－70℃凍存，使用前復融，離心，取上清液使用。

1.3 藥物體內緩釋實驗方法 成年健康新西蘭大白兔30只，體質量為2～2.5 kg(海軍總醫院動物室)，外科手術，分離氣管前組織，對氣管外壁(約第2～5氣管環)不斷搔刮至明顯充血，形成瘢痕組織。分別將0.2 ml載有不同的藥物劑量(0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 mg)的聚乳酸凝膠與明膠海綿的混勻后置于損傷后的氣管外壁，并用半圓形的硅膠管固定，逐層縫合手術切口，于給藥前和給藥后的1、3、7、10、14 和 21 d，由耳緣靜脈采血 1 ml。將取得的全血置肝素抗凝處理過的離心管中，3 000 r·min－1離心 15 min，取上層血漿，置－70℃保存，待測。

1.4 血漿樣品前處理方法 血漿室溫解凍后，精密吸取200 μl兔血漿于4.0 ml eppendorf管中，加內標溶液10 μl(10 mg·L－1曲安奈德甲醇溶液)，振蕩混勻，再分別加入乙酸乙酯2.2 ml，振蕩2 min，以6 000 r·min－14℃離心 5 min，取上清液 2.0 ml于40℃離心濃縮揮干后，加200 μl流動相復溶，振蕩1 min，于7 000 r·min－14℃高速離心5 min，取上清液10 μl進樣分析。

1.5 超高效液相色譜條件 色譜柱:Thermo Hypersil Gold C18(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)，預柱:Phenomenex Security Guard C18(4 mm×3.0 mm);流動相:甲醇:0.1%甲酸水溶液=90∶10，流速:0.2 ml·min－1，等度洗脫，柱溫:35。進樣量為 10 μl，整個分析時間為3 min。

1.6 質譜檢測條件 離子化方式為電噴霧(ESI);選擇反應監測(SRM);檢測離子為正離子。鞘氣壓力(N2)為20 arb(3 500 kPa)，輔助氣壓力(N2)為5 arb(1.5 L·min－1)，碰撞氣壓力(Ar)1.5 mTorr(0.2 Pa)，噴霧電壓4 500 V，離子傳輸管溫度為300℃，掃描時間為 0.2 s，掃描寬度為 0.2 amu。MMC的碰撞能量(CE)為15 eV，采集離子為m/z 335.2→242.2。內標物曲安奈德的采集離子為m/z 435.2→415.2(8 eV)/397.3(11 eV)。

1.7 標準樣品和最低定量限(LLOQ) 于10支具塞離心管中加入兔空白血漿200 μl，精密加入MMC標準溶液，使血漿中 MMC濃度分別為 1，2，5，20，50，100，200，500，800，1 000 μg·L－1，按“血漿樣品前處理方法”項下測定，記錄樣品及內標峰面積，用樣品濃度對樣品峰和內標峰面積之比作線性回歸。配制6份MMC的血漿樣品濃度為1 μg·L－1，并根據當日標準曲線求得每一樣本的測定濃度。

1.8 準確度與精密度 考察日內、日間準確度與精密度(5 d)。按標準曲線配制方法制備含MMC(5，100，800 μg·L－1)低、中、高3 種濃度的含藥血漿樣品，測定后記錄峰面積比值。根據隨行標準曲線求得準確度與精密度。

1.9 提取回收率及基質效應 配制含MMC濃度為5，100，800 μg·L－1的血漿樣品各 6 份，按“血漿樣品前處理方法”項下操作，與相應濃度的純品溶液，加入內標對比。測定后以提取后的色譜峰面積與相同濃度樣品未經提取獲得的色譜峰面積之比，計算提取回收率。

取空白血漿，除不加內標外，其余按“血漿樣品前處理方法”項下操作得上清液，添加適當濃度的MMC標準溶液，測得的峰面積和以流動相添加MMC標準溶液測得的峰面積之比，在5，100，800 μg·L－1的3個濃度平行6份樣品評價MMC在血漿中的基質效應。

1.10 穩定性考察 考察5和800 μg·L－1MMC血漿樣品在室溫放置0、2、4 h，－20℃冰箱內冷凍保存0、6、28 d及3次凍融循環后的穩定性。

2 結果

2.1 質譜條件的優化 取1.0 mg·L－1的MMC和內標物的標準溶液，在ESI源正離子檢測方式下進行一級質譜分析(Q1掃描)和二級質譜分析(子離子掃描，Q2掃描)，得到各自的碎片離子，進而優化噴霧電壓和碰撞能量，以準分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度得到最大時為最佳。將UHPLC與串聯四級桿質譜儀連接，選擇各自的監測離子對，再對離子傳輸管溫度、透鏡電壓、鞘氣壓、輔助氣壓等進行優化，使進樣溶液中樣品的離子化效率得到最佳，得到本實驗的質譜條件(見Tab 1):鞘氣壓20 arb(3 500 kPa)，輔助氣 5 arb(1.5 L·min－1)。

Tab 1中，MMC全掃描一級質譜得到準分子離子峰［M+H］+為基峰，對此峰進行產物離子全掃描質譜分析，主要生成碎片離子為m/z 242.2，該碎片離子峰為［M+H］+脫去HOCONH2得到m/z 274.1碎片離子峰［M+H-HOCONH2］+，繼續脫去CH3OH得到的［M+H-HOCONH2-CH3OH］+峰，m/z 242.2碎片離子穩定且強度大，為基峰。內標曲安奈德全掃描一級質譜主要生成［M+H］+峰，對此峰進行產物離子全掃描質譜分析，曲安奈德碎片離子較多，選擇響應較強且穩定的碎片離子，主要為:脫去HF生成m/z 415.2離子;進一步脫水生成m/z 397.3的離子。

Tab 1 UHPLC-MS/MS parameters for mitomycin C and IS

2.2 色譜分離和專屬性 在本色譜質譜條件下，測定乙酸乙酯萃取處理過的空白血漿樣品、添加0.5 mg·L－1內標溶液的血漿樣品、含有0.05 mg·L－1分析物和0.5 mg·L－1內標溶液的血漿樣品和兔氣管外壁給藥后采集血漿樣品，比較上述4種血漿樣品選擇反應監測模式(SRM)下獲得的色譜圖(見Fig 1)。采用優化后的色譜條件以及SRM方式，其專屬性強，靈敏度高，血漿中的內源性物質不干擾分析物與內標物的測定，且內標物獨立出峰不干擾分析物的分離。

2.3 標準曲線及最低定量限(LOQ) 按“1.5”項下方法測定的標準曲線為Y=0.007854X+0.0008116，r=0.997 7(權重系數 W:1/x2)。MMC血藥濃度在1～1 000 μg·L－1范圍內線性關系良好，相關系數對于0.997。對于靈敏度的測定，標準曲線的最低濃度被認為最低定量限(LLOQ)，因此MMC 的 LLOQ 為 1 μg·L－1，其日內與日間準確度和精密度分別為94.88%(RSD=9.9%，n=6)和93.52%(RSD=6.9%，n=3)，此濃度下MMC的偏差小于20%，標準曲線中其它各點的峰面積的偏差小于15%。以定量離子對3倍信噪比(S/N)的響應值對應的樣品濃度作為檢出限(LOD)，因此MMC的 LOD 為 0.2 μg·L－1。

2.4 準確度與精密度 本方法的日內與日間準確度和精密度通過分析 5，100，800 μg·L－1這 3 個濃度水平的各6個血漿樣品5 d內得到的，分別在95.71% ～105.44%(RSD≤6.9%，n=6)和93.71% ～106.0%(RSD≤5.8%，n=5)。結果表明，準確度與精密度在可接受范圍內(±15%)，符合生物樣本測定指導原則的要求。

2.5 提取回收率與基質效應 MMC在低、中、高3個濃度的提取回收率分別為95.46%±3.68%、104.9% ±2.23%和92.54% ±2.64%，結果基本一致。基質效應分別為98.61% ±4.61%、94.95% ±2.89%和95.23% ±3.85%，沒有觀察到基質對于離子化(離子抑制或離子增強現象)的影響，本試驗方法可以有效排除內源性物質對測定的干擾，提高靈敏度，能夠在較低的濃度水平上完成MMC的定性和定量分析。

Fig 1 Typical UHPLC-MS/MS chromatograms of mitomycin C and triamcinolone acetonide in rabbit plasma

2.6 穩定性試驗 MMC血漿樣品(5和800 μg·L－1)在室溫放置4 h測定結果分別為95.08% ±6.47%和100.9% ±3.26%，含量沒有下降;將血漿樣品于－20℃冰箱中分別儲存28 d，測定結果分別為98.20% ±4.29%和105.2% ±3.91%，含量沒有

出現變化;將血漿樣品經歷3次凍融循環后，測定結果分別為95.94% ±3.48%和101.0% ±2.42%，含量沒有下降。結果表明，MMC在上述條件下穩定性良好，保證了分析過程中實驗操作的可靠性。

2.7 兔血漿樣品測試與方法應用 將本方法應用于兔氣管外壁給藥后血藥濃度的測定中，每組6只成年健康兔，外科手術，將0.2 ml載有(0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 mg)MMC的聚乳酸凝膠與明膠海綿的混合體置于氣管外壁。于給藥后不同時間采血，從耳緣靜脈取血1 ml，測定血漿樣品中的MMC濃度(結果見Tab 2)。

Tab 2 Plasma concentrations after single dose(0.05，0.1，0.2，0.4 and 0.6 mg)of mitomycinC-polylactide gel of ectotheca to rabbits(±s，n=6)

Tab 2 Plasma concentrations after single dose(0.05，0.1，0.2，0.4 and 0.6 mg)of mitomycinC-polylactide gel of ectotheca to rabbits(±s，n=6)

Time point Plasma concentration/μg·L －1 0.05 mg 0.1 mg 0.2 mg 0.4 mg 0.6 mg 1 d － － － 0.11 ±0.04 0.80 ±1.4 3 d － － － 0.13 ±0.07 －7 d 0.20 ±0.24 0.56 ±0.68 0.24 ±0.15 0.41 ±0.48 0.22 ±0.04 10 d 0.42 ±0.52 0.25 ±0.19 0.18 ±0.11 0.10 ±0.08 －14 d 0.20 ±0.19 0.36 ±0.25 0.11 ±0.03 0.11 ±0.06 0.22 ±0.15 21 d － － － 0.10 ±0.05 －

3 討論

本文采用UHPLC-MS/MS方法，測定新西蘭大白兔氣管外壁給予絲裂霉素C聚乳酸凝膠后血漿內絲裂霉素C的濃度，并對體內可能釋放的原型藥物進行了初步確證與定量，方法專屬性強、靈敏度高、分析時間短等特點，尤其適用于大批量生物樣品測定。

本實驗對樣品前處理方法、色譜條件及質譜條件進行了優化。為了更有效地避免內源性物質的干擾，縮短樣品前處理時間，選擇乙酸乙酯為提取溶劑并去除血漿雜質，萃取效果好，易于分離，操作簡單且回收率高。流動相中加入少量甲酸可以提高離子化效率，改善色譜峰形，提高靈敏度，有效排除內源性物質引起的基質效應。內標物的選擇與絲裂霉素C性質相似，不干擾待測物的測定，并且得到良好分離。

質譜條件選擇效應較高的ESI源，采用正離子方式檢測，優化質譜參數。由一級質譜選擇其分子離子，二級質譜選擇其主要子離子，根據兩者子離子的色譜峰面積比定量。這種定量分析方法具有很強的專屬性，且定量準確。

聚乳酸被用作緩、控釋系統的載體材料，用于半衰期短或口服生物利用度低的藥物，其優點可在幾周甚至幾個月內以一定速率釋放藥物。絲裂霉素C與聚乳酸制成凝膠制劑用于局部給藥，具有良好靶向性并保持藥物活性，而體內緩釋且吸收量少，血液濃度低，對全身的影響不大，可預防喉氣管瘢痕組織形成并對瘢痕組織形成的抑制作用。

本文研究了絲裂霉素C-聚乳酸凝膠兔氣管外壁給藥后體內釋放量，在反復摸索與調整試驗中確定了UHPLC-MS/MS條件，通過方法學驗證和應用，證明該方法具有靈敏度高、操作簡便、快速、準確等優點，但測定的絲裂霉素C含量極低，無法進行藥代動力學計算。可能是由于絲裂霉素C的給藥部位為氣管外壁，原型藥物難以吸收入血，因此血漿藥物濃度極低，且低于本方法的最低定量限，其結果有待于進一步證實。同時，還需摸索絲裂霉素C-聚乳酸凝膠的其它給藥劑量或給藥方式，并建立更靈敏的分析方法，以探究此劑型在體內的藥動學行為。

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