ACE2通過下調AT1R和ERK1/2的磷酸化而抑制平滑肌細胞的增殖

曹金龍，龔晶婧，許昌聲，王華軍，盧卓強，晉學慶

(福建醫科大學附屬第一醫院心內科，福建省高血壓研究所，福建福州 350005)

腎素－血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)是一個復雜的體液調節系統，它與心血管疾病如高血壓病、動脈粥樣硬化等疾病的發生密切相關［1］。血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)在RAS系統中發揮著重要的病理生理學作用，AngⅡ可以通過其特異的血管緊張素Ⅱ1型受體(AngiotensinⅡ type 1 receptor，AT1R)及其下游信號分子實現多種生物學作用，如AngⅡ可以通過細胞外基質激 酶 (Extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)信號通路介導平滑肌細胞增殖、遷移等［2］，血管平滑肌細胞的增殖會導致血管壁增生肥厚，是高血壓病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的病理基礎。自從2000年Donoghue等［3］研究發現一種與血管緊張素轉換酶(ACE)是同源物質的血管緊張素轉換酶2(Angiotensin-converting enzyme，ACE2)以后，這為RAS研究開辟一個新領域。ACE2與ACE的不同在于它是一種單羧基肽酶，可以水解AngⅡ生成Ang(1-7)，研究發現Ang(1-7)可以對抗AngⅡ介導的多種生物學作用［4］。雖然過去的研究發現ACE2可以作為一種重要的負向調節因子對抗AngⅡ介導的的多種心血管疾病的發生。然而，關于ACE2發揮作用的具體機制目前仍然不是十分清楚，本研究利用載有ACE2基因的慢病毒表達載體感染SD大鼠胸主動脈平滑肌細胞，研究ACE2的過表達對AT1R表達的影響，觀察 ACE2過表達對ERK1/2磷酸化水平的變化以及平滑肌細胞增殖的影響，以期進一步闡明ACE2對平滑肌細胞增殖影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 SD成年大鼠(120～150 g)(福建醫科大學實驗動物中心)♀♂不限，慢病毒表達載體(Lentiviral-ACE2))和空載體慢病毒(Lentiviral-GFP)由上海Genechem基因技術公司協作構建和擴增;AngⅡ購自(美國，Sigma公司)，ACE2兔抗大鼠一抗、AT1R兔抗大鼠一抗購自(美國Abcam公司)、ERK1/2和p-ERK1/2兔抗大鼠一抗購自(美國CST公司)、β-actin小鼠抗大鼠一抗、山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗購自(美國Santa Cruz公司)，磷酸酶抑制劑Cocktail購自(美國 Invitrogen公司)，DMEM培養基、胎牛血清購自(美國Gibco公司)，RIPA細胞裂解液(RIPA Lysis Buffer)，蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)，Cell Counting Kit-8(CCK-8 Kit)試劑購自(碧云天生物技術有限公司)。

1.2 平滑肌細胞的培養與實驗分組 SD大鼠胸主動脈平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的培養，采用組織貼塊法進行平滑肌細胞原代以及傳代培養，免疫細胞化學法鑒定平滑肌細胞［5］。選用培養至第3代的平滑肌細胞，使用含體積分數為0.1胎牛血清的完全培養液以5×104細胞/孔接種于6孔培養板。在37℃，5%CO2的細胞培養箱中培養，待細胞生長融合至孔底面積的0.5～0.6時，慢病毒以感染復數MOI為10感染平滑肌細胞不同時間并分組為:對照組、空載體組、感染24、48、72和96 h組;待細胞長滿6孔板底面積的0.80 時，AngⅡ以 10－7mol·L－1濃度分別孵育不同時間并分組為:對照組、3、6、9、12 和 15h 組;慢病毒感染平滑肌細胞96 h后，繼續加入AngⅡ孵育12 h后提取總蛋白，并分各干預組為:對照組、Lentiviral-GFP、AngⅡ、AngⅡ +Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-ACE2和Lentiviral-ACE2組;同樣慢病毒感染平滑肌細胞96 h后，相繼加入AngⅡ孵育5 min后提取總蛋白，并將各干預組分組為:對照組、AngⅡ、Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-ACE2和Lentiviral-ACE2組。

1.3 熒光顯微鏡觀察慢病毒綠色熒光蛋白表達細胞接種同上，將慢病毒(Lentiviral-GFP)以感染復數為10(multiplicity of infection，MOI=10)感染平滑肌細胞，感染12 h后換成新鮮的的完全培養液，共計培養96 h后，在熒光顯微鏡(放大倍數為×100)下觀察慢病毒綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達情況。

1.4 細胞增殖的測定 采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測平滑肌細胞增殖，利用細胞線粒體中的脫氫酶還原性與底物顯色可間接反映細胞數目。選用第3代平滑肌細胞，使用含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，用含體積分數為0.1胎牛血清的DMEM培養液配成細胞懸液，光鏡下計數，以5×103細胞/孔接種于96孔板中且每孔體積定容為100 μl，并將各干預組分組為:對照組、Lentiviral-GFP、AngⅡ、AngⅡ +Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-ACE2 和Lentiviral-ACE2組，每組設5個復孔，并設置空白背景組。以MOI=10將慢病毒感染細胞96 h后，隨后加入 AngⅡ(10－7mol·L－1)干預 24 h，然后每孔內加入 CCK-8 增殖反應液 10 μl，在 37℃、5%CO2培養箱內孵育1.5 h，在酶標儀上450 nm處檢測其吸光度。

1.5 Western blot 采用常規Western blot法檢測ACE2、AT1R蛋白以及ERK1/2的磷酸化水平，待各組完成干預后，吸掉培養液，在6孔板內各孔加2 ml 4℃預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS 0.01 mol·L－1pH 7.4)或TBS緩沖液，重復以上操作兩次，共洗細胞3次以洗去培養液。在各孔加入200 μl RIPA細胞裂解液(RIPA Lysis Buffer)(1 ml RIPA裂解液加10 μl PMSF(100 mmol·L－1)和 10 μl Cocktail磷酸酶抑制劑)，待細胞充分裂解后，提取總蛋白，采用BCA法對總蛋白進行定量，取30 μg總蛋白進樣于預灌制的7.5%聚丙烯酰胺凝膠中，電壓100 V、SDSPAGE電泳2 h，按1～2 mA·cm－2電流轉膜1.5 h將蛋白電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，ACE2一抗(1 ∶1 000)、AT1R 一抗(1 ∶1 000)、ERK1/2和pERK1/2一抗(1∶2 000)、β-actin一抗(1∶2 000)4℃過夜、用含(1∶1 000)吐溫的Tris緩沖液(TBST，pH=7.4)洗膜3×10 min、然后在山羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h、TBST洗膜3×10 min，最后加入ECL發光劑、曝光、顯影和定影，采用Image J(1.44)軟件對特異性條帶進行半定量分析。

1.6 統計學方法 應用SPSS11.5軟件進行統計學分析，計量數據用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 慢病毒感染平滑肌細胞后目的蛋白的表達

如Fig 1所示，A圖是可見光視野，B圖為綠色熒光視野，熒光顯微鏡下可見細胞核以及細胞質，兩圖均可見綠色熒光蛋白。提示慢病毒表達載體能夠高效表達目的蛋白質。如Fig 2所示，慢病毒感染平滑肌細胞不同時間后，ACE2蛋白的表達量呈時間依賴性增加，慢病毒感染平滑肌細胞24 h后ACE2蛋白的表達量開始增加，慢病毒感染細胞96 h ACE2蛋白表達量較對照和空載體比較均有明顯增加(1.23±0.06vs0.54±0.03和0.54±0.09，P＜0.05)，說明載有ACE2的慢病毒隨時間依賴性高效表達ACE2蛋白。

2.2 ACE2過表達對平滑肌細胞增殖的影響 如Fig 3所示，AngⅡ可以明顯促進平滑肌細胞的增殖(0.68±0.03vs0.40±0.02，P＜0.05)。ACE2過表達后明顯抑制AngⅡ誘導的細胞增殖作用與單用AngⅡ組比較(0.53±0.102vs0.68±0.03，P＜0.05)，同時發現單用Lentiviral-ACE2感染平滑肌細胞后有抑制平滑肌細胞增殖作用(0.26±0.06vs0.40±0.02，P＜0.05)。提示無論在有或無 AngⅡ孵育情況下ACE2均具有抑制平滑肌細胞增殖的作用。

Fig 1 Effect of lentiviral-GFP transfection on vascular smooth muscle cells(MOI=10)

Fig 2 ACE2 protein expression after gene transfection in vascular smooth muscle cells(n=4)

Fig 3 Effects of ACE2 gene transfection on VSMCs proliferation(n=4)

2.3 ACE2過表達對AT1R表達的影響 如Fig 4所示，AngⅡ(10－7mol·L－1)孵育平滑肌細胞不同時間后AT1R成時間依賴性上調，并且AngⅡ在作用12 h較對照組比較AT1R開始明顯升高(0.24±0.01vs0.12±0.01，P＜0.05)。如 Fig 5所示，ACE2對AngⅡ誘導的AT1R的上調與單用AngⅡ組比較有明顯抑制作用(0.34±0.07vs0.72±0.07，P＜0.05)，同時發現單用ACE2慢病毒感染平滑肌細胞較無AngⅡ干預組比較也具有下調AT1R作用，提示無論在有或無AngⅡ作用下，ACE2均可以下調AT1R。

Fig 4 Effects of angiotensinⅡon AT1R expression in vascular smooth muscle cells(n=4)

Fig 5 Effects of ACE2 overexpression on AT1R expression in vascular smooth muscle cells(n=4)

2.4 ACE2蛋白過表達對ERK1/2的磷酸化水平的影響 如Fig 6所示，AngⅡ孵育平滑肌細胞后ERK1/2的磷酸化水平明顯升高。空載體慢病毒對AngⅡ誘導ERK1/2的磷酸化水平與單用AngⅡ組比較差異無顯著性，但ACE2過表達對AngⅡ誘導的ERK1/2的磷酸化水平較單用AngⅡ組比較有明顯抑制作用(0.43±0.06vs0.71±0.08，P＜0.05)，同時載有ACE2基因的慢病毒感染平滑肌后有抑制ERK1/2的磷酸化(0.28±0.06vs0.39±0.04，P＜0.05)，提示ACE2過表達可以抑制ERK1/2的磷酸化水平。

*P＜0.05 vs control and GFP;#P＜0.05 vs AngⅡ and AngⅡ +GFP

3 討論

本研究發現，ACE2蛋白過表達明顯抑制平滑肌細胞的增殖并且具有下調AT1R以及抑制其下游信號分子ERK1/2的磷酸化水平，提示ACE2抑制平滑肌細胞增殖可能是通過抑制AT1R的上調和ERK1/2的磷酸化水平而實現的。

Gurley等［6］的研究發現在ACE2基因敲除的小鼠模型研究中，ACE2缺陷的小鼠心血管功能發生嚴重紊亂，提示ACE2在心血管系統中發揮有重要作用。國內有研究報道，ACE2的升高可以改善心肌重塑［7］并且具有血管保護作用［8］，這些現象提示我們，研究ACE2在心血管系統中所發揮作用的具體機制，對于我們深入的了解腎素血管緊張素系統在心血管疾病中的作用以及指導心血管疾病的臨床治療具有重大意義。然而，國內外對于ACE2抑制平滑肌細胞增殖及其相關機制鮮有報道。本研究使用載有ACE2基因的慢病毒表達載體感染平滑肌細胞，觀察ACE2過表達對平滑肌細胞增殖的影響，進一步研究ACE2對AT1R的表達以及信號分子ERK1/2磷酸化影響，探討ACE2對平滑肌細胞增殖影響的可能機制。

首先，本研究進一步證實AngⅡ具有促進平滑肌細胞增殖的作用，這一結果與之前的研究結果相一致，如Dzau等［9］研究表明AngⅡ可以通過AT1R介導促細胞增殖等多種生物學作用。另外發現ACE2蛋白過表達明顯抑制AngⅡ誘導的平滑肌細胞增殖，同時還發現平滑肌細胞在無外源性AngⅡ刺激下，ACE2也具有抑制平滑肌細胞增殖效應，這一結果目前國內外少有相關報道。Ferrario等［10］研究表明ACE2發揮生物學作用主要是通過水解AngⅡ生成Ang(1-7)，Ang(1-7)通過MAS受體發揮抑制細胞增殖、降血壓、抗炎和抗氧化應激等作用。具體機制目前主要認為一方面可能是Ang(1-7)促進緩激肽的增加或者是直接通過AT2R受體而發揮抑制細胞增殖等生物學作用，另一方面，如Deddish等［11］研究發現Ang(1-7)可以直接通過抑制ACE而發揮對抗AngⅡ介導的生物學作用。然而，我們研究發現ACE2過表達具有下調AT1R的作用，這與Zhang等［12］研究結果是一致的，這一發現提示ACE2抑制平滑肌增殖有可能是通過下調AT1R而實現的。

其次，Santos等［13］研究表明 AngⅡ可以通過AT1R及其下游多種信號分子如 Rac 1、JNK、p38MAPK等介導細胞增殖、血管收縮、增加氧化應激等病理生理作用。本研究發現ACE2過表達后對ERK1/2的磷酸化有明顯抑制作用。已有的研究表明ACE2作用主要是通過降解AngⅡ生成Ang(1-7)而發揮生物學作用，如Su1等［14］研究發現，Ang(1-7)能夠抑制AngⅡ誘導的近端小管細胞的MAPK磷酸化水平，且這種抑制作用能被Ang(1-7)的特異性受D-Ala7-Ang(1-7)所阻斷，提示Ang(1-7)可能是通過MAS受體抑制了ERK1/2的磷酸化。然而，我們發現ACE2過表達后明顯抑制平滑肌細胞AT1R蛋白表達以及其下游信號通路ERK1/2的磷酸化，這與Zhong等［15］研究結果一致，但其具體分子機制有待于我們更進一步研究。

總之，本研究發現 ACE2可以通過對AT1RERK1/2通路的影響而抑制平滑肌細胞的增殖從而發揮血管保護的作用，血管平滑肌細胞的增殖與高血壓、動脈粥樣硬化和PCI術后血管再狹窄等多種心血管疾病的發生密切相關，對于心血管疾病的臨床治療具有重要意義。對于ACE2在心血管疾病中所發揮具體作用的分子機制的研究，為其今后可能在心血管疾病治療中的臨床應用提供理論依據。

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