P2X2/3受體在大鼠眶下神經慢性壓迫性損傷中表達水平的動態變化

趙莉莉，雷 潔，王元銀，，劉安東，解 敏，楊 晨，陳葉俊，孫 輝，周 健，王烈成，張志愿

(1.安徽醫科大學口腔醫學院，安徽省口腔疾病研究省級實驗室，安徽合肥 230032;2.安徽醫科大學基礎醫學院生理學教研室，安徽合肥 230032;3.上海交通大學第九人民醫院，上海 200011)

目前多數學者認為三叉神經根的脫髓鞘改變是三叉神經痛(trigeminal neuralgia，TN)的病理基礎。三叉神經節(trigeminal ganglion，TG)分布有P2X1-6等多種受體［1－2］，P2X2/3 受體高選擇性地表達于中、小直徑TG神經元中，與痛覺傳遞密切相關［3］。本實驗擬建立大鼠眶下神經慢性縮窄性損傷(chronic constriction injury to the infraorbital nerve，CCIION)模型，觀察其行為學改變及 TG神經元中P2X2/3受體表達量的動態變化，以探討P2X2/3在CCI-ION所致的TN的TG神經元過程中的變化規律，為TN的臨床治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級♂ SD大鼠85只，80～120 g。隨機分為3組，正常對照組(Ⅰ組)5只;手術組(右側為Ⅱ組，左側為Ⅲ組)和假手術組(Ⅳ組)術后每周各取5只作相應的手術處理。

1.2 CCI-ION 模型建立 1.814 mol·L－1水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠仰臥位，消毒后作右側眉弓上弧形切口，暴露眶下神經，兩根結扎線間距約2 mm結扎眶下神經，Ⅳ組只暴露不結扎。

1.3 行為測試 將各組大鼠在術后每周行機械痛域測試，感覺測試儀由IITC Life Science公司提供，刺激部位為觸須部位及周圍有毛皮膚，輕觸甚至未有任何觸碰大鼠表現出明顯的退縮、攻擊或搔臉行為時記錄為痛域值，每只大鼠刺激5次取平均值。

1.4 HE和免疫組化 術后每周處死大鼠取TG，HE染色行形態學觀察，免疫組化方法檢測P2X2/3的表達情況。

1.5 統計學分析 數據用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，以±s表示，各組各時間點與Ⅰ組比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 行為學改變 模型組大鼠出現痛覺超敏現象，較Ⅰ組疼痛閾值明顯降低(P＜0.01)。見Fig 1。

Fig 1 Changes of mechanical withdrawal threshold of ION-CCI rats in each group(n=5)

2.2 形態學改變 Ⅰ組:胞膜完整，胞核大小、形態正常，神經纖維光滑連續、粗細均勻。Ⅱ組:細胞染色不均，髓鞘增粗，纖維迂曲腫脹斷裂(Fig 2)。

2.3 免疫組化染色 各組 TG中均能檢測出P2X2/3免疫反應陽性細胞(Fig 3)。

Fig 2 Changes of the HE staining after the surgery in the control group and the CCI-ION surgery group

TG neuron，detected in middle and small diameter neurons A:P2X2 receptor;B:P2X3 receptor

2.3.1 P2X2/3表達陽性細胞率改變 鏡下行陽性細胞和總細胞計數，得出陽性細胞率。Ⅱ組P2X2/3陽性細胞率明顯提高，隨著術后時間的延長呈現上下波動，但始終高于Ⅰ組水平(P＜0.01)。見Fig 4。

2.3.2 P2X2/3不同時間段的表達變化 用光學顯微鏡計算機圖像分析系統測量背景灰度作P2X2/3的表達強度分析。Ⅱ組P2X2/3平均光密度一直明顯高于Ⅰ組(P＜0.05)。見Fig 5。

Fig 4 Changes of the rate of positive cell experssing P2X2/3 receptor in trigeminal ganglion of each group after CCI-ION(n=5)

3 討論

ATP 與神經系統的生理活動密切相關［4－5］，傷害性剌激使感覺神經末梢本身釋放大量ATP激活P2X受體［6－7］，促進谷氨酸釋放，誘發動作電位產生疼痛感覺［8－9］。研究顯示P2X2/3受體參與多種疼痛產生的過程，P2X2主要介導急性神經病理痛，而P2X3主要介導慢性神經病理性痛的發生［10－11］。研究表明，CCI-ION模型可能損傷了包繞在神經元外的星形膠質細胞，釋放ATP，從而導致神經元的激活并誘導產生神經性痛［12－14］。

Fig 5 Changes of P2X2/3 receptor experssion in trigeminal ganglion of each group after CCI-ION(n=5)

本實驗通過對P2X2/3受體表達情況的檢測發現，Ⅱ組P2X2/3的表達與其它各組相比呈上調趨勢，1W陽性細胞率明顯提高，推測可能是由于手術機械性損傷引起的代償反應;P2X2/3平均光密度值較其它各組各時間點也明顯增多，提示其與大鼠TN密切相關，介導了 TN的發生。Ⅳ組術后早期P2X2/3陽性細胞率及表達量較Ⅰ組均顯著提高，晚期則差異無顯著性，提示術后早期由于手術急性損傷造成急性期炎性反應，之后隨著炎癥的消退和TG的自我修復而有所恢復。Ⅱ組P2X2受體平均光密度2周升高達高峰后逐漸降低，5周后又表現出升高后降低的變化趨勢提示P2X2可能與三叉神經痛的陣發性發作特征有一定關系，主要參與急性痛或炎性痛。與Ⅳ組相比，Ⅲ組在術后早期P2X3受體陽性細胞率及表達量差異均無顯著性，而到晚期兩者均明顯高于Ⅳ組，并一直持續到觀察結束，可能是由于術后早期由于手術損傷引起對側繼發炎性反應，后期手術側痛覺的神經傳導對對側TG產生了影響，這與臨床上TN的發病特征有相似性，但具體的作用機制需要進一步的研究。

綜上所述，P2X2/3參與了TN的誘發、痛覺傳遞過程，其中P2X2主要參與急性痛或炎性痛，而P2X3對急性痛及痛疼的維持都起重要作用;而手術對側組P2X3表達量的變化說明手術側的痛覺神經傳導對對側TG產生了影響。

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