腦脊液中D-Ser對齒狀回顆粒細胞層突觸傳遞和可塑性相關蛋白的作用研究

謝奇辰，殷衛東，錢天秀，陳思維，王曉英

(1.中國醫學科學院藥用植物研究所藥理中心，北京 100193;2.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈 陽 110016;3.山東淄博臨淄區人民醫院，山東 淄博 255400)

包繞大腦的腦脊液中富含各種神經遞質，由于腦內神經元胞外液與腦脊液互相的交換和交流，所以腦脊液幾乎含有所有大腦調節物質，成為大腦調節物質分泌、傳輸、交流的場所。近年來，由于D-Ser在神經元和膠質細胞對話聯系中擔任重要角色而成為神經科學領域的研究熱點。大量研究證實，D-Ser是NMDA受體甘氨酸位點的內源性配基，由L-Ser經膠質細胞富含的絲氨酸消旋酶產生而來［1－3］。臨床研究也發現神經精神病人如精神分裂病人以及老年癡呆病人腦脊液中的D-Ser濃度與正常人水平具有明顯差別，所以深入研究中樞神經系統中D-Ser的功能作用對于神經精神相關疾病病理機制的研究以及藥物發現具有重要理論意義。

1 材料與方法

1.1 動物和手術 ♂ SD大鼠，體質量300～350 g，單籠飼養(光照:07∶00～19∶00 h)。動物以苯巴比妥鈉(60 mg·kg－1，ip)。麻醉后，固定于離體定位儀，進行側腦室定位，打孔，種植給藥婁管。同時另鉆孔以3個小螺絲將其固定，以牙托粉固定。3 d后，隔天進行 IgG 2.5 g·L－1和 anti-D-Ser IgG 2.5 g·L－1(購自 United States Biological)注射，注射 3次后，動物進行電生理測定和蛋白表達測定。

1.2 實驗儀器 VC-11記憶示波器 (Nihon Koden，日本);SEN-7203三道電子刺激器(Nihon Koden，日本);SS-202 J刺激隔離器(Nihon Koden，日本);SR-6N立體定位儀 (Narishige，日本)。

1.3 電生理測定［4］最后1次Anti-D-Ser IgG注射后2 h，以烏拉坦麻醉大鼠(1.5 g·kg－1，ip)，固定于離體定位儀，以同樣的方法埋植刺激電極和記錄電極。刺激電極定位坐標為:P 7.5－7.8，L 4.4－4.6，H 3.5－4.0;記錄電極坐標為:AP 3.7－4.0，L 2.4－2.7，H 3.0－3.5。根據已定位坐標的位置，將給藥簍管及記錄電極放入所在腦區。以固定強度的刺激記錄慢慢調整刺激和記錄電極的位置，直到誘導出最大群峰電位。而后給予不同強度的電刺激，記錄誘發的動作電位，得到輸入輸出曲線。刺激(0.033 Hz，100 μs)電流強度以引起最大興奮性突觸后電位的1/2－1/3為檢測刺激強度，之后將電極固定。以高頻刺激(HFS，100 Hz，100 μs，10 串，5 個刺激方波，串間隔刺激為200 ms)，誘導LTP刺激強度與測試刺激相同。

1.4 誘發電位的記錄和幅值的計算方法 實驗中以PS幅度相對值(%)為觀測指標，觀察其給藥后的增幅情況。將給藥前30 min所記錄的6個時間點PS幅度值的平均值作為自身基礎突觸傳遞水平(自身基礎幅值)，并以此PS均值為100%。用給藥后所測各時間點的PS幅度值除以基線的6個時間點的PS平均值，得到各時間點的PS幅度相對值。

1.6 Western blot檢測和抗體 Western blot操作流程如前所述進行操作［5－6］。大概步驟如下，將皮層、海馬在預冷的RIPA緩沖液中(1%Igepal CA-630，0.5%sodium deoxycholate，0.1%SDS，1 mmol·L－1PMSF，10 g·L－1aprotinin，1 mmol·L－1sodium orthovanadate in PBS buffer，pH 7.4)超聲勻漿，以BCA測定試劑盒檢測蛋白濃度，勻漿液以2x SDS-PAGE上樣緩沖液稀釋至2 g·L－1，樣本蛋白進行電泳分離，然后轉移至PVDF(Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)膜。PVDF膜與溶于含有5%脫脂奶粉的PBS緩沖液的一抗在4℃孵育通宵。各一抗濃度如下:GAP43(1∶4 000，購自美國Cell Signaling Technology)，Synapsin Ⅰ，MAP2(1 ∶700，購自美國 Cell Signaling Technology)。而后，膜以PBS進行3次震蕩沖洗，與二抗1∶5 000室溫孵育60 min，同樣進行沖洗后，以ECL顯色法進行沖洗(購自Pierce Biotechnology)，條帶以NIH imagine進行半定量分析。

Fig 1 Baseline of PS amplitude in perforant path-dentate gyrus synapse(±s，n=5)

2 結果

2.1 腦脊液中D-Ser對齒狀回顆粒細胞層突觸傳遞的影響 如 Fig 1所示，在測試刺激(0.033 Hz，100 μs)下，對照組 PS 幅度在 10、30、60、90 min 分別是(103.2±8.6)%、(97.6±7.6)%、(100.5±8.2)%、(97.3±7.3)%，anti-D-Ser組的PS幅度分別為(99.8±7.2)%、(95.6±7.4)%、(103.2±9.6)%、(102.5±8.7)%。對照組和 anti-D-Ser組的基礎突觸傳遞至90 min時沒有明顯變化，呈現穩定狀態。

HFS(100 Hz，100 μs)高頻刺激后，在 10、30、60 min的 PS幅度為(182.4±15.1)%、(175% ±13.5)%、(177.8±15.6)%，相比較而言，高頻刺激后10、30、60、90 min 后 Anti-D-Ser組的 PS 幅度分別為(112.3±9.8)%、(120.3±12.0)%、(118.3±13.6)%。anti-D-Ser組PS幅度下降，anti-D-Ser IgG抑制了齒狀回LTP的誘導(Fig 2)。

Fig 2 Effect of anti-D-Ser IgG on efficacy of synaptictransmission in perforant path-dentate gyrus synapses(±s，n=5)

2.2 腦脊液中D-Ser對突觸可塑性相關蛋白表達的影響 如Fig 3～5所示，大鼠皮層和海馬部位用于檢測抗D-Ser IgG注射后蛋白表達的變化以觀察腦脊液中D-Ser對突觸可塑性的影響。抗D-Ser IgG使皮層的GAP-43表達升高約52%，海馬部位約58%。而抗D-Ser IgG組皮層MAP2的表達降低約32%，海馬降低約59%。抗D-Ser IgG使皮層的synapsinⅠ表達降低約45%，海馬部位降低約57%。結果顯示了抗D-Ser IgG注射后MAP2和SynapsinⅠ的表達在海馬和皮層均下降，而且海馬MAP2和SynapsinⅠ蛋白的表達對腦脊液中D-Ser濃度的變化較皮層更為敏感。

Fig 3 Western blot of GAP-43 expression in control and anti-D-Ser IgG-treated rat brain(±s，n=5)

Fig 4 Western blot of MAP2 expression in control and anti-D-Ser IgG-treated rat brain(±s，n=5)

Fig 5 Western blot of Synapsin I expression in control and anti-D-Ser IgG-treated rat brain(±s，n=5)

3 討論

我們曾驗證了腦脊液中物質對中樞神經系統功能具有調節作用，如慢性ET-1免疫球蛋白注射可調節內源性鴉片系統［5－6］。包繞大腦的腦脊液中富含各種神經遞質，由于腦內神經元胞外液與腦脊液的互相交通，腦脊液幾乎含有所有大腦調節物質，包括氨基酸。所以腦脊液提供了一個大腦調節物質分泌、傳輸、交流的場所。有研究表明，中樞神經精神相關疾病患者腦脊液中某些蛋白的參數會發生明顯改變，Hashimoto等［7］報道臨床精神病患者腦脊液中的D-Ser水平明顯下降，D'Aniello等［8］發現老年癡呆病人腦脊液中的兩種氨基酸呈現出明顯變化。Bendikov等［9］報道了D-Ser濃度明顯影響了精神病病人的臨床癥狀。我們在前期工作的基礎上［4－5］，以抗D-Ser IgG進行中樞注射，降低腦脊液中的 DSer水平，來反向推測D-Ser在其中的作用。結果表明抗D-Ser IgG明顯阻礙了齒狀回顆粒細胞層LTP的誘導，本研究所進行的在體實驗的結果與Henneberger等所報道的離體實驗的研究結果相吻合［10－11］，同時海馬和皮層部位的突觸可塑性相關蛋白的表達也發生了明顯的變化。突觸可塑性相關蛋白的表達為突觸形態變化的內在機制，如生長相關蛋白GAP-43、微管相關蛋白MAP-2以及突觸素synapsinⅠ。MAP2存在于神經元的胞體、樹突和樹突棘，參與構成細胞骨架、突起生長、胞質蛋白運輸、神經元塑形等功能，其丟失涉及到神經元結構破壞，導致神經功能障礙。抗D-Ser IgG使皮層和海馬的MAP2表達降低。突觸素synapsinⅠ特異性定位于軸突終末的突觸囊泡膜上，反映軸突終末結構的分布［12］。synapsinⅠ的改變可能引發多種神經精神障礙，它通過磷酸化與去磷酸化作用調節神經遞質釋放、參與突觸發育，是突觸功能的物質基礎［13－14］。抗D-Ser IgG使皮層和海馬synapsinⅠ表達降低，同MAP2的變化一致。臨床發現精神病人腦脊液中的D-Ser水平明顯下降，病人死后檢測結果表明其海馬的 MAP-2表達亦呈明顯性下降［15－16］，這同本研究的結果相吻合。

有趣的是我們發現海馬MAP2和SynapsinⅠ蛋白的表達對腦脊液中D-Ser濃度的變化表現出更高的敏感性。本研究發現中樞注射抗D-Ser IgG后，海馬部位的MAP2和synapsisⅠ蛋白表達的變化較皮層更為敏感。這涉及到一個中樞抗體注射后的擴散均勻度和作用是否徹底的問題，也即抗體進入后是通過局部擴散滲透到腦組織中作用還是通過腦脊液進行作用，也曾有報道認為IgG進入側腦室后會不能均勻分布［17］，我們曾就此進行了專門的驗證［5－6］，我們采用了大腦勻漿進行檢測，并沒有發現殘留的IgG，也沒有發現皮層或海馬部位殘留的IgG。結果表明抗D-Ser IgG通過側腦室進入中樞后，進行了有效的全腦作用，與學習記憶能力有密切關系的海馬對D-Ser水平的變化更為敏感。

相比之下，GAP-43蛋白的表達在海馬和皮層均呈上升趨勢，GAP-43主要分布于生長錐和突觸前末端，可促進神經元的生長、發育、神經再生及突觸重建。在生長錐，GAP-43可促進F-肌動蛋白的聚集，使生長錐在形態上更具活力，并抵抗其回縮。我們推斷GAP43表達的增加是由在抗D-Ser IgG進入中樞后所導致的突觸傳遞的障礙所引起的蛋白表達的負反饋反應所致。Rekart和Chambers等也報道了相似的臨床檢驗結果，老年癡呆患者死后解剖分析結果顯示伴隨著D-Ser水平的降低，其GAP-43在海馬腔隙分子層，以及精神分裂病人的門區，內分子層的表達升高［18－19］，本研究結果與臨床研究的新發現是相吻合的。

總之，研究結果表明腦脊液中D-Ser具有重要的中樞調節作用，這對精神分裂病人和老年癡呆患者的臨床治療新藥物和治療方法的發現提供了理論支持。

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