在Hs578T乳腺癌細胞由Cx43組成的細胞縫隙連接對阿霉素細胞毒性的影響

蔣國君，童旭輝，祝曉光，董淑英，韓 溪，鄭 超

(蚌埠醫學院藥學系藥理學教研室，安徽蚌埠 233030)

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，化療是常見的治療手段。阿霉素(adriamycin，ADM)易產生心臟毒性、骨髓抑制、消化道反應等嚴重的不良反應，因此尋找增加乳腺癌細胞對ADM敏感性同時降低機體不良反應的方法，對減少耐藥、增加ADM的療效和擴大其臨床應用范圍具有重要的指導意義。

細胞縫隙連接(gap junction，GJ)是細胞間進行物質交流的主要連接通道，由特殊的通道蛋白——連接蛋白(connexin，Cx)組成。連接蛋白通道介導的細胞間信號轉導對于細胞正常生理狀態的維持以及機體內環境的穩定非常重要［1］。

目前已經證實，在人正常的乳腺組織中，Cx43是乳腺上皮細胞表達的特異性連接蛋白之一［2］，具有抑制腫瘤生長的作用，并且有研究證明，Cx43的存在可以增強化療藥物誘導的細胞凋亡作用［3］。在乳腺癌細胞中Cx43基因表達常常異?；蛘呷笔В?］。因此，國內外許多學者也將提高腫瘤間GJIC功能作為了腫瘤治療研究的新方向［5－6］。

本實驗主要研究維甲酸(ratinoic acid，RA)、油酸酰胺(oleamide)和 18-α-甘草次酸(18-α-GA)對乳腺癌Hs578T細胞中Cx43表達的影響，進而觀察由Cx43形成的GJ對抗腫瘤藥物ADM細胞毒性的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細胞 細胞系Hs578T購于中科院上海細胞庫。

1.1.2 試劑 阿霉素、胰蛋白酶(Typsin)、MTT、二甲基亞砜(DMSO)均為美國Sigma公司產品;DMEM高糖培養基、新生牛血清、熒光染料CM-Dil、calcein-AM(Molecular Probes)均為美國Gibco公司產品。其他常用試劑均為國產分析純級。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 乳腺癌細胞 Hs578T采用DMEM高糖培養基，含有10%(V/V)新生牛血清，100 kU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素，置于37℃、含體積分數5%CO2以及飽和濕度的細胞培養箱中培養。細胞常規培養于培養瓶中，0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，一周傳代2～3次，傳代比例約為1∶3。

1.2.2 Western blot檢測 Hs578T細胞內 Cx43蛋白表達 收集穩定表達Cx43的乳腺癌細胞Hs578T，用細胞裂解液(總體積200 ml:100 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.4 20 ml、1 mol·L－1NaCl 28 ml、100 mmol·L－1CaCl21 ml、100 mmol·L－1MgCl221 ml、15 mmol·L－1NaN340 ml、Triton X-100 2 ml，用前加入蛋白酶抑制劑 12 μmol·L－1Leupeptin、1 mmol·L－1PMSF 各2 ml·L－1)冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量法(參照試劑盒說明書操作)測各組蛋白濃度，用細胞裂解液將各組蛋白稀釋至相同濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min使蛋白變性。取蛋白 200 μg/組，12%SDSPAGE 凝膠電泳(70 V，30 min;150 V，90 min);轉膜(50 V，180 min);5%脫脂牛奶室溫封閉過夜;一抗:1∶4 000稀釋，4℃孵育過夜;TPBS洗滌3次×15 min;二抗1∶4 000稀釋，室溫孵育2 h;TPBS洗滌3次×15 min，PBS洗滌1次×15 min;ECL發光試劑盒暗室發光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統采集圖像。

1.2.3 細胞免疫熒光法 檢測細胞膜Cx43蛋白表達 將細胞以5×104cells·L－1的密度接種于蓋玻片上，放置培養箱中培養2～3 d，待細胞生長穩定后，吸去培養基，PBS洗2次×5 min;4%多聚甲醛－0.1%Triton溶液室溫固定10 min，PBS洗2次×10 min;1%BSA封片2 h;一抗:1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次×10 min;二抗1∶500稀釋，濕盒37℃孵育2 h，PBS洗滌3次×10 min;碳酸甘油緩沖液封片;倒置熒光顯微鏡檢測。

1.2.4 細胞接種熒光示蹤法(Parachute Assay)測定Hs578T細胞間GJ功能 將表達有Cx43的乳腺癌細胞與熒光指示劑calcine-AM共同孵育，使calcine-AM進入細胞。該細胞稱為“供體細胞”(donor cell)。將“供體細胞”接種到表達有相同Cx，已生長融合的 Hs578T細胞(“接受細胞”，receiver cells)上，培養4 h。待形成穩定的GJ后，小分子的calcine(發綠色熒光)可以通過GJ進入相鄰的“接受細胞”，用熒光顯微鏡觀察，記錄GJ熒光傳遞功能。一個“供體細胞”周圍含有calcine的“接受細胞”數目多少作為GJ功能指標［7］。分別用GJ功能增強劑維甲酸鈉(RA)誘導細胞24 h，GJ功能抑制劑oleamide、18-α-GA分別誘導細胞 1h后，觀察細胞GJ功能改變(即熒光傳遞的變化)［8］。

1.2.5 MTT法檢測GJ功能對ADM細胞毒性的影響 將細胞按每孔190 μl(細胞密度為5×107cells·L－1)接種于96孔板，每組藥物濃度設5個復孔，藥物終濃度如下:1.5、3.0、6.0、12、24、48 μmol·L－1。檢測每組藥物濃度處理Hs578T細胞后24、48和72 h的細胞存活率，另設陰性對照組(不加藥物)和空白對照組(不加細胞，只加培養基)。加藥后24～72 h(藥物作用終點時間)終止培養，終止培養前4 h，每孔加 MTT 15 μl(5 g·L－1)，棄上清液，加入二甲基亞砜150 μl/孔，微量振蕩器震搖10 min，全自動定量繪圖酶標儀測定每孔的570 nm波長處吸光度A值，實驗重復3次。在細胞融合狀態下用GJ功能調節劑改變細胞GJ功能，觀察藥物處理細胞24 h后的細胞存活率。各試驗重復3次。

1.3 統計學分析 實驗結果使用SPSS 13.0軟件進行分析。數據資料以±s表示，兩組之間計量資料比較進行t檢驗，統計圖表采用Sigma Plot繪制。

2 結果

2.1 Hs578T細胞天然表達Cx43蛋白 本研究采用Western blot檢測細胞Cx43蛋白［9］，如Fig 1結果顯示，與空白對照組相比，10μmol·L－1RA預處理Hs578T細胞24 h，可以增加細胞Cx43表達水平。25 μmol·L－1的 oleamide 和 10 μmol·L－1的 18-α-GA分別預處理Hs578T細胞24 h，明顯降低細胞Cx43表達水平。

2.2 Hs578T細胞胞膜Cx43的表達 本研究在天然表達Cx43的Hs578T細胞，用“細胞免疫熒光法”(Immunofluorescence Assay)檢測Hs578T細胞膜上Cx43的表達(Fig 2)。

2.3 抗腫瘤藥物在一定濃度范圍內對Hs578T細胞的增殖抑制作用 不同濃度ADM刺激Hs578T細胞24、48和72 h，使用MTT法檢測細胞的存活率。由 Fig 3 可以看出:1.5 μmol·L－1～48 μmol·L－1的ADM作用組的細胞存活率明顯降低，其差異有統計學意義。隨著ADM濃度增加和作用時間的延長，細胞存活率也明顯降低，即呈時間、劑量依賴性。48.0 μmol·L－1ADM 處理 Hs578T 細胞 24、48和72 h后，細胞存活率分別為55.23%、25.89%和18.18%。

2.4 用藥物改變GJ功能對ADM細胞毒性的影響

2.4.1 GJ功能增強劑對ADM細胞毒性的影響

2.4.1.1 RA 對由 Cx43組成的 GJ熒光傳遞功能的影響 本實驗用 parachute方法，在天然表達Cx43 的 Hs578T 細胞中，觀察 RA(10 μmol·L－1)對由Cx43組成的GJ熒光傳遞功能的影響(Fig 4，5)。

Fig 1 Effect of RA，oleamide or 18-α-GA on the expression of Cx43 in Hs578T(±s，n=3)

Fig 2 Expression of Cx43 on the surface of Hs578T cells(n=3)

Fig 5的結果顯示，用RA預處理Hs578T細胞24 h，可以明顯增強由Cx43組成的GJ熒光傳遞功能。與對照組相比，RA處理后的細胞熒光傳遞率增強了39.52%。

Fig 3 Surviving fraction of Hs578T cells treated with ADM for 24，48 and 72 h(n=3)

Fig 5 Effect of RA on the dye spread through GJ composed of Cx43 in Hs578T cells(±s，n=3)

2.4.1.2 RA對ADM細胞毒性的影響 本實驗在Hs578T細胞生長融合(有GJ形成)和生長未融合(無 GJ形成)的狀態下，預先用 10 μmol·L－1的 RA處理細胞24 h增強GJ功能，然后再加入6 μmol·L－1的ADM，作用24 h后，用MTT法檢測細胞存活率(Fig 6)。

Fig 6的結果顯示，在高密度接種的細胞(生長融合，有GJ形成)，ADM單用組的細胞存活率為0.54±0.04，低密度接種的細胞(生長未融合，無GJ形成)，ADM單用組的細胞存活率0.59±0.03。高密度接種的細胞，用RA(本身對細胞生長無影響)預處理細胞以增強 GJ功能后，6 μmol·L－1的 ADM作用Hs578T細胞24 h，細胞的存活率低于單用ADM 的細胞(0.49±0.04，P＜0.01);結果表明，RA可以增強ADM的細胞毒性。而在低密度接種的細胞(生長未融合，無 GJ形成)，用 RA預處理后，ADM作用于細胞24 h，細胞的存活率與單用ADM組相比增加(0.65±0.04，P＜0.01)。

Fig 6 Effect of RA on cytotoxicity of ADM in Hs578T cells expressing Cx43(±s，n=3)

以上結果可以證明，在有GJ形成的細胞，RA可以增強抗腫瘤藥物ADM的細胞毒性，而在無GJ形成的細胞，RA不能對細胞間GJ進行調控。

2.4.2 GJ功能抑制劑對ADM細胞毒性的影響在天然表達Cx43的Hs578T細胞中，為了進一步證實細胞GJ對抗腫瘤藥物ADM細胞毒性的影響，本實驗采用公認的GJ功能抑制劑oleamide和18-α-GA，在細胞融合(有GJ形成)和細胞未融合(無GJ形成)兩種情況下觀察它們對ADM的細胞毒性的影響。

2.4.2.1 oleamide 和18-α-GA 對由 Cx43 組成的GJ熒光傳遞功能的影響 Oleamide和18-α-GA是目前公認的 GJ抑制劑［10－11］，能抑制由 Cx43，Cx37 等連接蛋白組成的GJ，因此，我們首先用parachute的方法學觀察這兩種抑制劑在天然表達Cx43的Hs578T細胞中對由Cx43組成的GJ熒光傳遞功能的影響(Fig 7，8)。

Fig 7 Effect of oleamide or 18-α-GA on dye spread in Hs578T cells expressing Cx43(n=3)

Fig 8 Effect of oleamide or 18-α-GA on the dye spread through GJ composed of Cx43 in Hs578T cells(±s，n=3)

Fig 8的結果顯示，用oleamide和18-α-GA預處理Hs578T細胞1 h，均可以抑制由Cx43組成的GJ熒光傳遞。與對照組相比，oleamide(25 μmol·L－1)或 18-α-GA(10 μmol·L－1)處理的 Hs578T 細胞，其熒光傳遞率分別降低了47.94%和66.19%。結果證明，oleamide和18-α-GA可以降低由Cx43組成的GJ功能。

2.4.2.2 oleamide 和 18-α-GA 對 ADM 細胞毒性的影響 本實驗在Hs578T細胞生長融合(有GJ形成)和生長未融合(無GJ形成)的狀態下，預先用25 μmol·L－1的 oleamide 和 10 μmol·L－1的 18-α-GA分別處理細胞 1 h，然后再加入 6 μmol·L－1的ADM，作用24 h后，用MTT法檢測細胞存活率(Fig 9)。

Fig 9 Effect of oleamide or 18-α-GA on the cytotoxicity of ADM in Hs578T cells expressing Cx43(±s，n=3)

Fig 9結果顯示:在高密度接種的細胞(生長融合，有GJ形成)，ADM單用組的細胞存活率為0.54±0.04，低密度接種的細胞(生長未融合，無GJ形成)，ADM單用組的細胞存活率為0.59±0.03。高密度接種的細胞，與單用ADM組相比，用oleamide(25 μmol·L－1)或 18-α-GA(10 μmol·L－1)(兩藥本身對細胞生長無影響)預處理細胞1 h后，6 μmol·L－1的ADM作用Hs578T細胞24 h，細胞的存活率明顯增加(P＜0.01);結果表明，在有GJ形成的細胞，oleamide和18-α-GA能降低ADM的細胞毒性。而在低密度接種的細胞(生長未融合，無GJ形成)，與 ADM 單用組相比，用 oleamide或18-α-GA，不影響ADM處理后的細胞存活率(P＞0.05)。

以上結果可以證明，在有 GJ形成的細胞，oleamide和18-α-GA可以抑制抗腫瘤藥物ADM的細胞毒性，而在無GJ形成的細胞，oleamide和18-α-GA不能對細胞間GJ進行調控，因此對ADM的細胞毒性無影響。

3 討論

Cx已經成為乳腺癌治療的熱點，該蛋白在不同組織中表達不同，其中Cx43是乳腺上皮細胞主要表達的連接蛋白，Cx43異常與乳腺癌之間的關系越來越受到關注。

腫瘤化療藥物的作用在某些情況下與細胞GJ功能密切相關［12－13］，文獻報道，恢復和上調腫瘤細胞的GJIC功能，可降低抗腫瘤藥物的濃度并降低其不良反應。其調節途徑主要有兩種:第一種是通過藥物誘導方法來恢復和上調腫瘤細胞GJIC功能。藥物誘導主要是通過藥物來誘導腫瘤細胞中Cx表達，促進細胞GJ的形成，從而加強細胞間的物質交流，如維生素 D、類維生素 A、某些黃酮類的藥物［3，14－16］等均可以通過增強細胞的 GJ功能抑制腫瘤細胞的生長、分化和增殖。第二種途徑是通過基因轉染的方法來恢復和上調腫瘤細胞的GJIC功能。

本實驗所選用的Hs578T細胞株天然表達Cx43，目前常用的GJ功能增強劑為RA，該藥物可以通過增加Cx43mRNA轉錄、Cx43蛋白的表達而增強GJ功能［17］。本實驗觀察了RA對乳腺癌細胞Hs578T中Cx43蛋白水平的影響，及對GJ功能的影響。結果顯示，RA可以明顯增強 Cx43蛋白的表達，及乳腺癌細胞中由此連接蛋白形成的GJ功能。本研究進一步在高密度(有GJ形成)和低密度(無GJ形成)兩種條件下觀察對ADM細胞毒性的影響，結果顯示，在GJ形成的Hs578T細胞中，RA可以明顯增強ADM的細胞毒性，表明RA增強ADM的細胞毒性是通過GJ實現的。

oleamide和18-α-GA是本實驗采用的兩種GJ功能抑制劑。oleamide的作用途徑尚不明確，通常認為該藥是通過選擇性地抑制鈣離子通過GJ的能力，從而抑制細胞的群體死亡［18］，油酸酰胺衍生物MI-18和MI-22，通過抑制由Cx26介導的GJIC，阻止細胞自發轉移，并且藥物的毒副作用較低［19］，但是對于oleamide對Cx43蛋白表達影響的研究較少。本研究證明，oleamide和18-α-GA均可不同程度地抑制乳腺癌細胞Hs578T中Cx43蛋白的表達，以及由Cx43形成的GJ的熒光傳遞，細胞毒性結果顯示，oleamide和 18-α-GA通過抑制 GJ功能，可降低ADM對Hs578T的細胞毒性。

本研究通過改變GJ的功能下測定ADM細胞毒性的方法證實了，由Cx蛋白形成的GJ功能對ADM抗腫瘤作用的影響，結果表明，改變和調節乳腺癌細胞中Cx蛋白的表達可能會為乳腺癌治療提供一個新的思路。

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