木犀草素聯(lián)合蘆丁抗6-羥多巴胺誘導(dǎo)的帕金森病大鼠震顫及神經(jīng)保護(hù)作用

何國榮，成銀霞，穆 鑫，李曉秀，于 昕，王月華，方蓮花，杜冠華

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，“藥物靶點研究與新藥篩選”北京市重點實驗室，北京 100050;2.煙臺大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東煙臺 264005)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中腦黑質(zhì)進(jìn)行性退變而引起的神經(jīng)退行性疾病，PD的發(fā)生與年齡老化、環(huán)境毒素以及遺傳易感性等因素有關(guān)。藥物治療是目前治療PD的主要方法，較為有效的是以左旋多巴為代表的多巴胺(dopamine，DA)替代療法，然而，長期應(yīng)用左旋多巴會出現(xiàn)運動波動和運動障礙等副作用，使用后期還會加速PD自然病程。針對其他靶點的藥物也存在療效不理想、副作用大等缺陷［1］。因此，尋找療效確切且副作用小的藥物成為抗PD藥物研究的熱點。

木犀草素(luteolin)廣泛分布在金銀花、菊花、青蘭、紫蘇、白毛夏枯草等植物中，具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用，臨床用于治療腫瘤，肝炎，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等。近期研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠抑制神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用［2－4］。蘆丁(rutin)又名蕓香苷，是主要存在于蕓香全草、豆科植物槐的花蕾、果實、金絲桃科植物紅旱蓮全草及蓼科植物蕎麥籽苗中的一種黃酮類化合物。研究表明蘆丁具有止血、降壓、抗炎、抗病毒、舒張血管、抑制腦梗死等多方面的生物學(xué)活性，其復(fù)方制劑對心腦血管疾病有明顯的治療作用，特別是血管性癡呆［5－6］。這些研究結(jié)果提示，木犀草素和蘆丁均對神經(jīng)退行性疾病可能有較好的療效。

本實驗室前期建立了6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損傷 SH-SY5Y細(xì)胞模型和促PC12細(xì)胞分化模型，對天然產(chǎn)物庫內(nèi)樣品進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)木犀草素和蘆丁組合物(mixture of luteolin and rutin，MLR)能劑量依賴性地減輕6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和促PC12細(xì)胞分化。本研究采用腦室內(nèi)注射6-OHDA制備PD大鼠模型，進(jìn)一步考察MLR對模型大鼠的行為及中腦神經(jīng)元損傷的改善作用，并從抑制炎癥、保護(hù)神經(jīng)元及恢復(fù)神經(jīng)元功能等方面探討MLR可能的作用機(jī)制，為其應(yīng)用于PD臨床治療提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Sprague Dawley(SD)大鼠，2～3月齡，♂，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號:SCXK(京)2007-0001。動物飼養(yǎng)條件為:溫度(22±1)℃，相對濕度:55%-65%，通風(fēng)干燥，12 h光照周期。

1.1.2 儀器 MP8001腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，DXP-2大小鼠轉(zhuǎn)棒儀和DZIL-2大鼠自主活動程序自動控制儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，BL-420E+生物機(jī)能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，5810R型高速低溫離心機(jī)(美國Eppendorf公司)，SM900冰凍切片機(jī)(美國Leica公司)，X71正置熒光顯微鏡(日本OLYPUS公司)。

1.1.3 試劑與藥品 MLR(美國 SYNORx，Inc.生產(chǎn)，批號:062107，含木犀草素和蘆丁各50%)。美多芭片(上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)，批號:SH 0502)。6-OHDA、DA、阿 樸 嗎 啡 (apomorphine，APO)、小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶(trysine hydroxylase，TH)抗體，購自Sigma-aldrich公司;多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine transport protein，DAT)抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)、購自Santa Cruz公司，羊抗小鼠IgG、卵白素-生物素過氧化物酶復(fù)合物(Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC)試劑盒、3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色劑，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 健康♂ SD大鼠，3%的戊巴比妥鈉(50 mg·kg－1，ip)麻醉，頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，在左側(cè)相當(dāng)于前腦內(nèi)側(cè)束(medial forebrain bundle，MFB)區(qū)的顱骨表面鉆孔，直徑約2.5 mm。清理腦膜后，行MFB兩點注射6-OHDA(4 g·L－1)，(1)TB:－2.3 mm，AP:－4.4 mm，ML:1.2 mm，V:－7.8 mm;(2)TB:+3.4 mm，AP:－4.0 mm，ML:0.8 mm，V:－8.0 mm。在三維推動器的引導(dǎo)下兩點各注射 6-OHDA 3 μl，注射速度 1 μl·min－1，注射完畢后留針10 min，緩慢退針。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素20萬U·d－1以防感染。大鼠清醒后置于籠內(nèi)正常環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2.2 模型評價 術(shù)后1周大鼠給予APO(0.5 mg·kg－1，sc)，于直徑40 cm的有機(jī)玻璃桶中觀察其運動變化，每周1次，連續(xù)測試2周，若大鼠恒定向右旋轉(zhuǎn)，且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞280 r/40 min，則視為造模成功，經(jīng)過上述方法篩選，獲得58只合格模型動物。

1.2.3 分組與給藥 將造模成功的58只PD大鼠隨機(jī)分為模型組、美多芭組(50 mg·kg－1，ig)、MLR低(125 mg·kg－1，ig)、中(250 mg·kg－1，ig)、高劑量(375 mg·kg－1，ig)組，另取手術(shù)并注射生理鹽水，經(jīng)檢測無旋轉(zhuǎn)運動的大鼠10只為假手術(shù)組，模型組10只，其他每組各12只，共6組。分組后即給予相應(yīng)藥物，假手術(shù)組與模型組大鼠灌胃給予蒸餾水2 ml，每日1次，連續(xù)3周。

1.2.4 行為學(xué)檢測 模型動物分組后每隔7 d進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為檢測。于給藥后30 min給予APO(0.5 mg·kg－1，sc)誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，記錄40 min 內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)(方法同“1.2.2”)。

1.2.5 大鼠肌電測定 清醒大鼠固定于實驗臺上，使用BL-420E+生物信號采集器記錄肌電。將肌電記錄電極固定在大鼠右側(cè)臀部肌肉，電極間隔約1 cm，參考電極接地，記錄震顫引起的肌電活動(electromyography，EMG)，震顫的程度采用EMG頻率和幅度表示。分別記錄1 min內(nèi)大鼠震顫的頻率和幅度，共3次，取平均值。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測 每組取5只大鼠，3%戊巴比妥鈉(50 mg·kg－1，ip)麻醉后開胸，動脈插管，以生理鹽水沖洗血液后灌注含0.04多聚甲醛的0.1 mol·L－1的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.2 ～7.4)固定組織，斷頭取全腦固定4 h，以含0.3的蔗糖的多聚甲醛固定液內(nèi)脫水，待組織下沉后修整組織塊，取中腦腹側(cè)作連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚為20 μm。切片首先與一抗(TH，1 ∶500;DAT，1 ∶200;GFAP，1∶400)4℃孵育過夜;然后分別與生物素標(biāo)記的二抗(1∶300)反應(yīng)1 h以及卵白素－生物素復(fù)合物反應(yīng)2 h，最后用含有DAB的緩沖液顯色。

神經(jīng)元計數(shù)方法:隨機(jī)選取每只大鼠腦切片5張，分別在右側(cè)黑質(zhì)(substantia nigra，SN)陽性細(xì)胞密集區(qū)中央部分取4個互不重疊的高倍視野，計數(shù)視野內(nèi)TH、DAT、GFAP免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.7 外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定 另取正常大鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，0.1的水合氯醛(300 mg·kg－1，ip)麻醉，俯臥固定。分離坐骨神經(jīng)干，刺激電極置于游離的坐骨神經(jīng)干近心端;引導(dǎo)電極置于坐骨神經(jīng)干遠(yuǎn)心端，兩電極相距約1 cm。采用BL-420E+型生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，刺激信號0.6 mv，0.02 ms，單刺激，信號記錄采集間隔為0.01 s，1 kHz濾波，引導(dǎo)信號放大50倍，計算神經(jīng)肌肉動作電位潛伏期，神經(jīng)傳導(dǎo)速度計算公式為:

V=刺激電極到引導(dǎo)電極的距離(mm)/潛伏期(ms)。

將0.1 g·L－1的普魯卡因溶液(Procaine)和0.1 g·L－1的MLR溶液直接滴在坐骨神經(jīng)上，觀察藥物對坐骨神經(jīng)信號傳導(dǎo)速度的影響，以生理鹽水組(normal saline，NS)作為對照組。每5 min給予一次電刺激并記錄電信號傳導(dǎo)速度，記錄30 min。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 假手術(shù)組大鼠無異常行為，模型組大鼠可見活動明顯減少、反應(yīng)遲鈍、肢體震顫、嗅探、偏斜、弓背、尾僵直、豎毛等異常行為。給予美多芭2 h內(nèi)大鼠僵住行為明顯，隨后緩解，給藥一段時間后大鼠的異常行為有所改善;MLR各給藥組大鼠在給藥后沒有僵住行為產(chǎn)生，持續(xù)給藥可改善模型大鼠出現(xiàn)的上述異常行為。

以APO誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)，其中，假手術(shù)組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無變化;模型組大鼠測定旋轉(zhuǎn)圈數(shù)維持360 r/40 min左右，美多芭(madopar)組于給藥后第1周旋轉(zhuǎn)圈數(shù)有所增加，其后2周恢復(fù)到給藥前水平，大鼠運動變化給藥前后差異無顯著性;MLR低、中、高劑量組給藥后大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)也無差異。各組大鼠給藥前后旋轉(zhuǎn)情況見Fig 1所示。

Fig 1 Rotational behavior in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(±s，n=10)

2.2 肌電活動 假手術(shù)組大鼠靜息狀態(tài)EMG無明顯可檢測信號，模型組大鼠可見連續(xù)的陣發(fā)性簇狀電信號(P＜0.01)，其節(jié)律與大鼠震顫活動的節(jié)律相一致，表現(xiàn)出PD模型大鼠的特殊癥狀特征。各給藥組給藥前EMG值與模型組無差異，給藥后40 min，與模型相比，陣發(fā)性簇狀電信號出現(xiàn)的頻率和幅度均明顯降低，且具有劑量依賴性;其中，MLR中、高劑量組改善模型動物震顫的作用優(yōu)于陽性對照藥美多芭組(Fig 2)。

Fig 2Tremor in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(±s，n=10)

2.3 免疫組織化學(xué)分析

2.3.1 大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)TH表達(dá) 假手術(shù)組大鼠SN的TH免疫陽性神經(jīng)元形態(tài)清晰，TH表達(dá)高，免疫活性強(qiáng)，細(xì)胞胞體和纖維染色較深，有明顯可見的免疫陽性突起;6-OHDA偏側(cè)損傷大鼠毀損側(cè)SN TH免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)目較假手術(shù)組下降95%(P＜0.01)，免疫活性差，胞質(zhì)著色淡，細(xì)胞輪廓不清晰。MLR各給藥組神經(jīng)元數(shù)目較模型組有所增加，中、高劑量組的作用與陽性對照藥美多芭相似(P＜0.01)，TH免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)目較模型組增加，MLR高劑量組TH免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)目約為模型組的499.14%(Fig 3)。

A:Representative photographs showing.sham(a)，6-OHDA(b)，6-OHDA+madopar(c)，6-OHDA+MLR(125mg·kg－1)(d)，6-OHDA+MLR(250 mg·kg－1)(e)，6-OHDA+MLR(375 mg·kg－1)(f);B:Summary of the effect of MLR on 6-OHDA induced TH immunoreactive neurons in the SN.＊＊P＜0.01 vs sham group，##P＜0.01 vs 6-OHDA group

2.3.2 大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)DAT表達(dá) DAT主要位于神經(jīng)元軸突和末梢的質(zhì)膜上。假手術(shù)組DAT表達(dá)高，免疫活性強(qiáng)，胞質(zhì)濃染，細(xì)胞輪廓較清晰。模型組DAT表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，免疫活性差，胞質(zhì)著色淺，細(xì)胞形態(tài)模糊。各給藥組均可改善6-OHDA所致DAT免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目的減少，MLR作用好于陽性對照藥美多芭，但差異未見顯著性(P＞0.05)(Fig 4)。

Fig 4 DAT positive neurons immunoreactivity in the SN of rats(±s，n=5)(×400)

2.3.3 大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)GFAP表達(dá) 假手術(shù)組GFAP表達(dá)較低，胞質(zhì)著色淡，模型組GFAP表達(dá)顯著增加(P＜0.01，比假手術(shù)組增加了188.59%)，胞質(zhì)著色加深，各給藥組均可降低GFAP免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目(P＜0.01)，MLR高劑量組GFAP免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目比模型組降低了43.68%(Fig 5)。

Fig 5 GFAP positive astrocyte immunoreactivity in the SN of rats(±s，n=5)(×400)

2.4 外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度 在給予生理鹽水時，大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度保持在0.4～0.8 m·s－1之間;而給予普魯卡因溶液5 min，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度迅速增加，然后傳導(dǎo)速度明顯下降。給予MLR后，神經(jīng)傳導(dǎo)速度沒有變化，提示MLR可能對神經(jīng)傳導(dǎo)速度沒有影響(Fig 6)。

Fig 6 The peripheral nerve conduction velocity in normal rats(±s，n=6)

3 討論

靜止性震顫是PD主要臨床特征之一。目前認(rèn)為，PD患者靜止性震顫主要與基底神經(jīng)節(jié)－丘腦－皮層傳遞環(huán)路有關(guān)。黑質(zhì)－紋狀體多巴胺能神經(jīng)纖維變性使這一環(huán)路中具有節(jié)律性放電活動的神經(jīng)元活動增強(qiáng)并同步化，最后通過運動皮質(zhì)的節(jié)律性興奮而產(chǎn)生震顫。目前，臨床針對靜止性震顫主要采用DA替代療法、抗膽堿藥物、選擇性乙酰膽堿受體拮抗劑等進(jìn)行治療，由于不良反應(yīng)明顯、難以控制疾病病理進(jìn)程等原因，亟需研發(fā)療效明顯、毒副作用小的抗 PD 藥物［1，7－8］。

本研究結(jié)果顯示，MLR各給藥組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)在給藥前后沒有變化，與模型組相比差異也無顯著性，表明MLR對APO誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)運動沒有影響，提示MLR抑制震顫的作用不是通過多巴胺受體產(chǎn)生的。行為學(xué)觀察證實，MLR對大鼠的運動障礙有改善趨勢。但是，目前還缺少可靠的量化指標(biāo)對運動障礙進(jìn)行評價。本研究首次將EMG檢測用于評價PD模型大鼠的震顫程度。結(jié)果表明，美多芭和MLR各劑量對大鼠震顫頻率和幅度有明顯的抑制作用，且MLR各給藥組具有良好的量效關(guān)系。該檢測方法的建立為抗PD藥物藥效學(xué)研究與作用機(jī)制考察提供了更有效的評價技術(shù)。

靜止性震顫即可以是中樞性震顫也可以是外周性震顫。在減輕震顫方面，MLR是否直接抑制外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度，目前仍不清楚。因此，考察了MLR對正常大鼠外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響。實驗結(jié)果表明MLR抑制大鼠震顫與外周神經(jīng)沒有直接關(guān)系。

本研究中，6-OHDA定位注射造成黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多，這與已有的研究報道一致。隨著病程的進(jìn)展，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量促炎因子導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡［9－10］。前期研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素和蘆丁的神經(jīng)保護(hù)作用均與其抗氧化、抗炎作用相關(guān)［3－6］。本實驗顯示，MLR可明顯增加TH 陽性細(xì)胞數(shù)目，并改善細(xì)胞狀態(tài)。另外，GFAP陽性計數(shù)與TH陽性計數(shù)相關(guān)性分析顯示，GFAP細(xì)胞數(shù)與TH細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生與DA能神經(jīng)元凋亡有關(guān)，而MLR可明顯降低GFAP陽性細(xì)胞數(shù)，提示MLR能夠抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子。

在PD發(fā)病過程中，各種損傷因素最終通過引起神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡導(dǎo)致功能障礙，到目前為止還沒有任何一種藥物或治療方式能夠完全阻斷PD的進(jìn)程。本研究證實，連續(xù)給藥3周，MLR可以劑量依賴性減輕大鼠震顫頻率和幅度，表明MLR在減輕模型動物震顫方面具有獨特的優(yōu)勢。此外，MLR能夠減輕6-OHDA造成的DA能神經(jīng)元損傷、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子，部分恢復(fù)DA能神經(jīng)元功能，延緩PD病理進(jìn)程。本研究為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了重要的基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

(致謝:感謝Thomas P.Lahey先生和 SYNORx，Inc公司提供實驗樣品及在研究過程中給予的幫助。)

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