二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫(DBDCT)對大鼠離體胸主動脈環的舒張作用及機制

楊彩紅，張軒萍，吳博威，李青山

(山西醫科大學1.藥理學教研室、2.生理學教研室、3.藥學院，山西 太 原 030001)

隨著很多腫瘤預后的改善，患者生存率的提高，對多個正常器官和組織產生毒副反應成為限制抗腫瘤藥物用量、阻礙療效發揮的主要問題，研發高效低毒的抗腫瘤藥物成為首選。本課題組將芳香異羥肟酸作為配體與有機錫合成，得到的系列芳香異羥肟酸類化合物已證實都具有高效廣譜的抗癌活性［1－2］。其中二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫(DBDCT)這一全新結構化合物作用尤為突出，使用 DBDCT對荷瘤裸鼠實驗結果表明，它們對SGC7901胃腺癌、Bel-7402肝癌等實體瘤有明確治療作用［3］，顯示了高效廣譜抗癌活性。在研究DBDCT的一般藥理學實驗中，發現DBDCT在體給藥可使血壓下降。DBDCT是否通過直接舒張血管作用而降低血壓?本研究選用大鼠離體胸主動脈環，觀察DBDCT對去甲腎上腺素和氯化鉀誘發的血管收縮的影響，并用多種工具藥探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫(DBDCT)由山西醫科大學藥學院藥物合成實驗室提供。純度高于98%。

左旋硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)、吲哚美辛(Indomethacin，Indo)、溴化四乙胺(tetraethylammonium bromide，TEA)、格列苯脲(glibenclamide，Gli)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、氯化鋇(BaCl2)、HEPES和EGTA均購自Sigma公司。其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器 BL-420F生物機能實驗系統購自成都泰盟科技有限公司;HSS-1B數字式超級恒溫浴鍋購自成都儀器廠;張力換能器(JH-2)購自高碑店市新航機電設備有限公司。

1.3 實驗動物 清潔級健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(由山西醫科大學實驗動物中心提供)，♂，2～3月齡，體質量250～300 g。

1.4 溶液配制 DBDCT溶劑配方:丙二醇 ∶檸檬酸緩沖液∶無水乙醇=4∶5∶1，檸檬酸緩沖液用生理鹽水配制，pH為3.40。

生理鹽溶液(physiological salt solution，PSS)，其成分為(mmol·L－1):NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，CaCl22.5，Glucose 11.1，HEPES 5。

60 mmol·L－1-K+PSS，其成分為(mmol·L－1):NaCl 89.8，KCl 60，MgCl21.2，CaCl22.5，Glucose 11.1，HEPES 5。

Free-Ca2+PSS，其成分為(mmol·L－1):NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，Glucose 11.1，HEPES 5，EGTA 0.5。

上述營養液均用1 mol·L－1NaOH將pH值調至7.4，預熱至37℃。實驗中所述濃度均為浴管內試劑的終濃度。

1.5 實驗方法

1.5.1 動脈環制備 參考文獻方法［4］，取出胸主動脈，迅速置入4℃預冷、氧飽和、pH值為7.4的PSS中，將動脈剪成2～3 mm的血管環，水平懸掛在10 ml浴管內，連接張力換能器，經BL-420F計算機生物信號采集分析系統記錄血管環的張力變化。浴管內含有通以100%O2、pH值為7.4、37℃的 PSS，前負荷調為2 g，平衡1 h，使之維持基礎張力在2 g的恒定水平，每20 min換1次營養液。所有動脈環用60 mmol·L－1KCl PSS液多次刺激，當標本對刺激收縮穩定后，即連續2次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別小于5%時，開始正式實驗。

1.5.2 去內皮動脈環制備 將修剪干凈的胸主動脈環兩端固定，用與血管內徑相適的棉棒從管腔擦過，連續2次。血管環懸掛穩定1 h后，用60 mmol·L－1KCl PSS液刺激，達到坪值后加入ACh(10－5mol·L－1)檢驗血管內皮的完整性，舒張幅度不超過收縮幅度的5%時認為內皮去除完全。

1.5.3 大鼠胸主動脈環舒張作用測定 采用內皮完整或去內皮的大鼠胸主動脈環，經60 mmol·L－1KCl PSS液刺激，待張力平衡后，用PSS液沖洗，使血管環張力恢復到刺激前的穩定張力水平后，加入NE(10－6mol·L－1)或 KCl(60 mmol·L－1)預收縮，然后加入 5×10－6mol·L－1的 DBDCT，對照組加入等容量的溶劑，描記張力曲線。以加入10－6mol·L－1NE 或 60 mmol·L－1KCl誘發的血管環的最大收縮幅度為100%，計算施加DBDCT后血管舒張幅度占最大收縮幅度的百分比，即加藥后舒張幅度與 10－6mol·L－1NE 或 60 mmol·L－1KCl誘發的血管環最大收縮幅度的百分比。

1.5.4 L-NAME、Indo、4-AP、Gli、TEA、BaCl2對 DBDCT效應的影響 采用內皮完整大鼠胸主動脈環，待張力平衡后，用 NE(10－6mol·L－1)或 KCl(60 mmol·L－1)預收縮血管，達到坪值后，分別加入LNAME(10－4mol·L－1)、Indo(10－5mol·L－1)、4-AP(10－3mol·L－1)、Gli(10－5mol·L－1)、TEA(10－2mol·L－1)或 BaCl2(10－3mol·L－1)，血管環張力進一步改變達到坪值后，加入5×10－6mol·L－1的DBDCT;對照組為收縮達坪值后，直接加入5×10－6mol·L－1的 DBDCT。記錄相應血管環張力并計算變化值，以 10－6mol·L－1NE 或 60 mmol·L－1KCl誘發的血管環的最大收縮幅度為100%，比較兩組最大舒張百分比變化的差異。

1.5.5 DBDCT對血管平滑肌外鈣內流和內鈣釋放的影響 采用內皮完整的成年大鼠離體胸主動脈環，血管穩定后加入 NE 10－6mol·L－1，血管環收縮達坪值后洗脫，平衡1 h，然后用無鈣 PSS液(含EGTA 0.5 mmol·L－1)沖洗 3 次，并孵浴 3 min。DBDCT 組加入DBDCT 5×10－6mol·L－1，對照組加入溶劑，孵浴 20 min，然后加入 NE 10－6mol·L－1，可見血管環產生迅速而短暫的收縮，待其舒張并平穩后，向各管內加入 CaCl22.5 mmol·L－1，可見血管環再次收縮并達峰值。記錄相應血管環張力并計算變化值，以10－6mol·L－1NE誘發的血管環的最大收縮幅度作為100%，比較兩組無鈣液中NE和CaCl2最大收縮百分比的變化值。

1.5.6 統計學處理 以NE或KCl誘發的收縮幅度作為100%，計算加入DBDCT后的張力變化百分比。比較各組間在相同濃度時張力變化的差異。結果以±s表示，采用SPSS軟件系統進行統計學分析，用兩樣本t檢驗進行顯著性檢驗。

Fig 1 Effect of DBDCT，vehicle on the contraction induced by NE(10 －6mol·L－1)in isolated thoracic aorta rings with intact endothelium(Endothelium+)or endothelium-denuded(Endothelium－)(±s，n=6)

2 結果

2.1 DBDCT對NE或KCl預收縮大鼠離體胸主動脈環張力的作用以及內皮對其作用的影響 DBDCT 對 NE(10－6mol·L－1)、KCl(60 mmol·L－1)預收縮的離體胸主動脈環均產生明顯的舒張作用。DBDCT 5×10－6mol·L－1對 NE(10－6mol·L－1)預收縮的離體胸主動脈環的舒張作用可從溶劑組的(0.47±0.63)%增大至(94.40±2.23)%，DBDCT 5×10－6mol·L－1對 KCl(60 mmol·L－1)預收縮血管環的舒張作用則為(11.69±1.76)%，與溶劑組相比，兩組張力變化差異均有統計學意義(P＜0.01)。DBDCT 對 NE(10－6mol·L－1)、KCl(60 mmol·L－1)預收縮的去內皮離體胸主動脈環也具有明顯的舒張作用，與內皮完整組相比，張力變化無統計學差異(P＞0.05)。見Fig 1，2。

2.2 L-NAME、Indo對DBDCT減弱NE收縮胸主動脈環的影響 L-NAME、Indo孵浴后，DBDCT對NE誘發的血管張力變化與無阻斷藥時比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。在NE預收縮的血管環上，加入 L-NAME 后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(112.65±13.12)%;對照組不加LNAME，直接加入 DBDCT 5×10－6mol·L－1，兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。加入Indo后，DBDCT的舒張百分比為(93.59±3.48)%，與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見Fig 3。

Fig 2 Effect of DBDCT，vehicle on the contraction induced by KCl(60 mmol·L －1)in isolated thoracic aorta rings in rats with intact endothelium(Endothelium+)or endothelium-denuded(Endothelium－)(±s，n=6)

2.3 4-AP、Gli、TEA、BaCl2對 DBDCT 減弱 NE 收縮胸主動脈環的影響 4-AP、Gli孵浴后，DBDCT對NE誘發的血管張力變化與無阻斷藥時比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。在NE預收縮的血管環上，加入 4-AP 后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(100.90±9.51)%;加入Gli后，DBDCT的舒張百分比為(92.25±2.90)%，與對照組不加阻斷藥直接加入DBDCT比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。見Fig 3。

TEA、BaCl2孵浴后，DBDCT的舒張作用減弱，差異有統計學意義(P＜0.05)。在NE預收縮的血管環上，分別加入 TEA 或 BaCl2，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比分別為(42.21 ±2.50)%和(42.43±3.12)%;與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見Fig 3。

Fig 3 Effects of L-NAME(10 －4mol·L －1)，Indo(10 －5mol·L －1)，Gli(10 －5mol·L －1)，4-AP(10 －3mol·L －1)，TEA(10 －2mol·L －1)，BaCl2(10 －3mol·L －1)on the relaxation induced by DBDCT in isolated thoracic aorta rings pre-contracted with NE(10－6mmol·L－1)(±s，n=6)

2.4 L-NAME、Indo對 DBDCT 減弱 KCl收縮胸主動脈環的影響 L-NAME、Indo孵浴后，DBDCT對KCl誘發的血管張力變化與無阻斷藥時比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。

在KCl預收縮的血管環上，加入L-NAME后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(17.40±3.28)%;對照組不加L-NAME，直接加入DBDCT 5× 10－6mol·L－1，其舒張百分比為(11.69 ±1.76)%，兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。在KCl預收縮的血管環上，加入Indo后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(15.15 ±3.05)%，與對照組不加阻斷藥直接加入DBDCT比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見Fig 4。

2.5 4-AP、Gli、TEA、BaCl2對 DBDCT 減弱 KCl收縮胸主動脈環的影響 4-AP、Gli孵浴后，DBDCT對KCl誘發的血管張力變化與無阻斷藥時比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。在KCl預收縮的血管環上，加入 4-AP 后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(13.77±3.22)%，加入Gli后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(16.32 ±2.91)%，與直接加入DBDCT不加阻斷藥比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見Fig 4。

同上方法，TEA、BaCl2孵浴后，DBDCT的舒張作用減弱，差異有統計學意義(P＜0.05)。在KCl預收縮的血管環上，加入TEA或BaCl2后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比分別為(8.94 ±1.09)%和(8.82±1.26)%，與不加BaCl2或TEA直接加入DBDCT比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Effects of L-NAME(10 －4mol·L －1)，Indo(10 －5mol·L－1)，TEA(10 －2mol·L －1)，4-AP(10 －3mol·L －1)，BaCl2(10 －3mol·L －1)，Gli(10 －5mol·L －1)on the relaxation induced by DBDCT in isolated thoracic aorta rings pre-contracted with KCl(60 mmol·L－1)(±s，n=6)

2.6 DBDCT對NE在無鈣液中的縮血管效應的影響 在無鈣 PSS液中，分別加入 DBDCT 5×10－6mol·L－1及同劑量溶劑，孵浴20 min后，加入 NE 10－6mol·L－1，血管環產生迅速而短暫的收縮，溶劑組和 DBDCT 5×10－6mol·L－1組的 NE 的收縮百分比分別為(20.44±1.60)%和(1.89 ±0.32)%，DBDCT組與溶劑組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，見Fig 5。待其舒張并平穩后，加入CaCl22.5 mmol·L－1，血管環再次收縮，溶劑組和DBDCT組的收縮百分比分別為(91.87±2.16)%和(1.60±0.48)%，DBDCT組與溶劑組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。見Fig 5。

3 討論

本實驗表明，DBDCT對內皮完整和去內皮血管環均有舒張作用，且其舒張作用在內皮完整和去除內皮離體動脈血管環差異無顯著性，提示DBDCT對血管的舒張作用可能主要是直接作用于血管平滑肌。一氧化氮(NO)和前列環素(PGI2)是典型的內皮釋放的血管活性物質，具有強大的舒張血管的作用。進一步的研究表明，在使用NOS抑制劑L-NAME和環氧合酶抑制劑Indo處理血管后，發現在NE或KCl預收縮的基礎上DBDCT舒張血管作用未被阻斷，提示NO途徑和PGI2可能未參加DBDCT的舒張血管作用。這些結果均證實DBDCT對血管的舒張作用與內皮舒血管因子的釋放無關，而可能是直接作用于血管平滑肌。

Fig 5 Effects of DBDCT(5×10－6mol·L－1)on NE(10 －6mol·L －1)induced contractions of the rat thoracic aorta rings in free-Ca2+PSS and CaCl22.5mmol·L －1(±s)

K+通道在調節血管平滑肌張力中具有重要作用，激活血管平滑肌上的K+通道，可引起細胞膜超極化，從而抑制細胞外鈣內流，引起血管舒張［5］。據文獻報道:在血管平滑肌上主要有4種鉀離子通道，即電壓依賴性鉀通道(KV)，內向整流鉀通道(Kir)，鈣激活鉀通道(KCa)和 ATP敏感鉀通道(KATP)［6］。本實驗結果顯示，TEA、BaCl2可以抑制DBDCT的舒血管作用，Gli、4-AP對DBDCT的舒血管作用無明顯影響。提示，KCa及Kir通道參與了DBDCT的舒血管作用，KATP和KV通道可能未參與其舒血管作用。

Ca2+是引起血管平滑肌收縮的關鍵因子［7］，血管平滑肌收縮所需要的Ca2+源于細胞外內流和細胞內釋放。鈣內流的途徑主要通過電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channel，VDC)、受體操縱性鈣通道(receptor operated calcium channel，ROC)、鈣釋放激活的鈣通道以及其他離子載體(Na+/Ca2+交換體、漏通道等)［8］。NE 誘導的血管收縮是作用于血管平滑肌上的α1腎上腺素受體，引起受體調控的鈣通道開放，Ca2+內流，但主要通過三磷酸肌醇(IP3)刺激內貯Ca2+的釋放引起血管平滑肌收縮［9］。KCl使血管平滑肌細胞膜去極化而刺激血管收縮，其機制主要是使VDC開放，從而促使細胞外液中或與細胞膜疏松結合的Ca2+內流［10］，從而引起平滑肌收縮。在本實驗中，DBDCT可抑制KCl引發的血管收縮，表明DBDCT引起的血管環舒張可能通過抑制VDC介導的細胞外鈣內流而舒張血管。DBDCT抑制NE引發的血管收縮，提示其可能抑制肌漿網鈣釋放和(或)抑制ROC。NE在無Ca2+PSS液中引起的短暫收縮是細胞內Ca2+釋放的結果，加入CaCl2后引起血管平滑肌進一步收縮被認為是細胞外Ca2+內流而產生的［11］。我們采用無Ca2+液和復Ca2+液的實驗方法，發現DBDCT能抑制NE在無Ca2+液中所引起的血管平滑肌短暫收縮和復Ca2+后的持久收縮，證明DBDCT可能通過影響外鈣內流和內鈣釋放發揮其舒血管作用。

綜上所述，本實驗結果提示DBDCT對NE和KCl誘發的大鼠胸主動脈環的收縮具有明顯的減弱作用，該作用無內皮依賴性，與內皮生成的NO和PGI2均無關，而可能是直接作用于血管平滑肌，與激活KCa和Kir通道，抑制鈣內流和肌漿網鈣釋放。

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