轉化生長因子β1與癲癇

李良勇，王 玉

(1.安徽中醫學院第一附屬醫院腦病中心，安徽合肥 230031;2.安徽醫科大學第一附屬醫院神經內科，安徽合肥 230032)

癲癇是神經系統的常見病之一，具有反復發作及不可預測的特點，癲癇的發病率為人群的1‰，年患病率為5‰～7‰，我國估計難治性癲癇患者不少于100萬［1］，因此進一步探索癲癇發病機制，尋找新的防止癲癇發生及控制癲癇發作的手段十分必要。轉化生長因子 TGF-β1(transforming growthfactorbeta1)是一種多功能細胞因子，具有廣泛性生物學作用，系列研究證實，TGF-β1與神經系統的許多生理、病理過程有關［2-3］，并發揮著神經保護作用。隨著研究的深入，人們發現TGF-β1與癲癇有著密切的關系，已成為神經科學界研究的熱點，本文就TGF-β1在癲癇發病中的作用、涉及的可能的機制及相關的信號轉導途徑進行綜述。

1 TGF-β的生物學特性及信號傳導

TGF-β是一種多功能細胞因子，由多種組織細胞合成，以自分泌、旁分泌和內分泌的方式，通過細胞表面的受體信號轉導途徑調控著細胞的增殖、分化、黏附、轉移和凋亡，并參與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成以及血管生成等生理學過程，在涉及纖維化、損傷修復、骨骼重建和腫瘤生長等的許多病理學過程中發揮重要作用。活性TGF-β是由二硫鍵連接的兩個各含112個氨基酸亞單位組成的二聚體多肽，分子量為25 kDa。TGF-β共有5種異構體，哺乳動物的 TGF-β 有 TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3 三種亞單位，具有高度的同源性，三者在體外的作用相似，但在體內的生物學特性卻不盡相同［2-4］。

TGF-β1和相關因子的信號轉導是通過細胞表面的TGF-β受體介導的。TGF-β的信號轉導始于TGF-β與細胞表面Ⅱ型受體上的二聚體結合形成復合體，然后I型受體識別并結合該復合體，形成I型受體一配體一Ⅱ型受體三聚體復合體。在此過程中，Ⅱ型受體胞內結構域的Ser/T-hr蛋白激酶結構域通過使I型受體胞內GS結構域磷酸化而激活I型受體，活化的I型受體再磷酸化，進一步作用于胞內下游分子Smads蛋白，激活的Smads蛋白進入細胞核，和其它的核協同或抑制因子結合，調節目標基因轉錄，使TGF-β信號轉導人胞質。Smad家族是最早被證實的TGF-β受體激酶的底物，存在于細胞質中，可將信號由胞膜直接傳至胞核。細胞內至少存在Smad(l-9)9種分子［2-3］。

細胞內至少存在Smadl-9 9種分子，按結構和功能可分為3個亞型:① 受體激活型Smad(receptor-activatedSmad，RSmad)，包括 Smad 1、2、3、5、8、9，其中 Smad2、3 則可被 TGF-β激活，作為TGF-βRI激酶的直接底物，活化后與通用型Smad(Co-Smad)形成復合物異位人核，轉導特異性信號，調節靶基因的轉錄;② 通用型Smad(common-partnerSmad，Co-Smad)，哺乳動物中僅有Smad4，能與活化的R-Smad形成異聚體，在信號轉導中起瓶頸作用;③ 抑制型Smad(inhibitory Smad，I-Smad)，包括 Smad6、7，可阻斷受體介導的 R-Smad磷酸化，阻礙活化的R-Smad與Co-Smad異聚體的形成，還可與活化的受體或受體激活的Smads競爭性結合形成無活性復合物，從而對R-Smad和Co-Smad介導的基因表達產生抑制作用［2-3］。

2 TGFβ1與癲癇

2.1 TGF-β1在癲癇中的正面作用及其相關機制分析Morgan［5］等用海仁藻酸(KA)誘導海馬培養細胞邊緣發作(limbic seizure)，研究發現注射KA 4 h后受損的神經元中TGFβ1mRNA表達增高，2 d后達到高峰。體內TGFβ1缺乏的轉基因鼠(TGFβ1-/+)，注射KA后，癲癇發作更明顯，神經元損傷更嚴重，并出現廣泛的神經元凋亡現象［6］。杏仁核點燃大鼠模型中TGFβ1mRNA表達水平比對照組明顯增高［7］。由此，在癲癇發作時TGFβ1可能具有潛在的神經保護作用。且近年來有研究報道，腦缺血缺氧參與了匹羅卡品誘導的SE后選擇性神經元損傷機制［8］。而TGFβ1在缺血缺氧腦損傷中具有神經保護作用［9］，由此，我們推測TGFβ1對SE后海馬神經元損傷神經保護作用可能與前者有著相似的機理。其機制可能涉及以下幾個方面:①既往研究表明TGFβ1能夠降低海馬神經元鈣離子濃度，防止神經元內鈣離子超載，維持神經元鈣離子穩態［10］。而鈣穩態失調，可使細胞內鈣流增加引起神經元興奮，且鈣穩態失調亦可通過影響神經遞質釋放引起興奮抑制功能失調并可以觸發一系列反應并最終導致神經元死亡從而參與癲癇發生［11］。② Prehn把培養的鼠腦細胞置于含1 mML谷氨酸的無血清培養基中，在加入谷氨酸后立刻給予TGFβ1，18 h后發現，1～10 ng的TGFβ1可明顯減輕谷氨酸的毒性;且進一步研究發現，TGFβ1能拮抗谷氨酸鹽的神經毒性作用，下調NMDA受體的過度活化［12］從而發揮神經保護作用。谷氨酸是腦內重要的興奮性遞質，其能夠激活NMDA受體，產生神經毒性并可觸發癲癇發作［11］。③ TGFβ1通過上調 bcl-2(抗凋亡蛋白)，抑制caspase-3(促凋亡蛋白)等內源外源性途徑抑制癲癇神經元的凋亡［13］。癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)可導致海馬等結構的神經元選擇性死亡或凋亡，且這種選擇性神經元死亡又能促進癲癇的形成和進展［11］。我們的研究已經證實外源性TGFβ1在癲癇大鼠中具有抗凋亡等神經元保護作用(文章待發表)。

TGFβ1還可通過上調靶細胞星形膠質細胞PAI-l表達和抑制tPA引起的神經元鈣離子內流增加來保護神經元［14］。tPA(組織型纖溶酶原激活劑)可通過NMDA受體誘導神經元鈣離子內流，其機制與tPA裂解NMDA受體的NRI亞基有關，而鈣離子內流增加可以觸發一系列反應并最終導致神經元死亡。Pal-1(纖溶酶原激活劑抑制劑-1)是tPA的天然抑制劑，tPA/PAI-1軸在NAMD介導的興奮性毒性中起重要作用［14］。不僅如此，TGFβ1可通過抑制靶細胞小膠質細胞中的氧自由基而發揮作用［15］。上述的機制推測將是以后我們實驗進一步研究的方向。

2.2 TGF-β1在癲癇中的負面作用及其相關機制分析

2.2.1 TGFβ1在癲癇中的負面作用 Ivans等破壞鼠血腦屏障建立腦損傷模型，或把白蛋白直接暴露于大腦新皮層，導致皮層功能紊亂，并記錄到皮層癲癇樣放電。深入研究發現白蛋白由TGF-βR(受體)介導被星形膠質細胞吸收，引起星形膠質細胞鉀離子通道內部整流功能下降和細胞外高鉀，導致NMDA受體過度活化，甚至癲癇樣放電。且指出白蛋白被星形膠質細胞而非神經元吸收，且運用TGF-βR阻斷劑可顯著減少癲癇樣放電［16］。后Ivans又進一步研究發現破壞血腦屏障暴露TGF-β1，產生的現象和上述一樣。即TGF-βR介導TGF-β1被星形膠質細胞吸收產生癲癇樣放電。因TGFβ1信號轉導時TGFβ1首先與細胞膜表面的TGFβRⅡ二聚體結合，形成二元復合物，自動磷酸化時激活TGFβRⅠ，活化的TGFβRⅠ在進一步作用于細胞內的下游分子Smads蛋白，使TGFβ1的信號向細胞內轉導。于是研究者認為白蛋白由TGFβRⅡ介導被星形膠質細胞吸收，并提示TGFβ1號轉導途徑可能參與了癲癇的形成機制［17］或TGFβ1可通過相關信號轉導途徑形成癲癇樣放電。癲癇具有反復發作的特點，而我們的研究發現外源性TGFβ1可明顯抑制SE大鼠的自發性發作的次數和程度，并可發揮抗海馬神經元凋亡等神經保護作用(文章待發表)，從而提示TGFβ1可通過另一信號轉導途徑抑制癲癇的自發反復性發作。“癲癇耐受”最早由Kelly＆Mclntyre提出，相關機制的研究已成為研究熱點并逐漸在各種動物模型中得到揭示。即一次或短暫的癇性發作誘導腦組織啟動內源性保護機制，提高腦組織對后續較嚴重的SE的耐受能力，可以表現為神經元凋亡或壞死減少，癲癇發作次數減少程度減輕，甚至可能影響癲癇的形成和發展［18-19］。上述TGFβ1在星形膠質細胞中介導的信號傳導路徑可能在癲癇模型中所產生的復雜的神經網絡機制中誘發內源性的保護機制，如上調NF-κB、Bcl-2或激發其它保護性的信號轉導路徑等，從而影響癲癇的形成和發展。

2.2.2 TGFβ1在癲癇中的信號轉導途徑 通過大量的文獻及研究對上述的可能的信號轉導路徑總結分析如下。①TGFβ1在信號轉導過程中激活兩種不同的 TGFβRⅠ即ALK1(activin-like kinase receptor 1)和ALK5;ALK1和ALK5又分別進一步激活下游分子Smad1/5和Smad2/3即ALK1/Smad1/5和ALK5/Smad2/3轉導途徑。深入研究發現，在腦損傷時，TGFβ1可通過ALK1/Smad1/5介導激活神經元核因子NF-κB，核因子NF-κB具有抗凋亡等神經保護作用。雖在海馬神經元受損時ALK5/Smad2/3同時被激活，但相對于ALK1/Smad1/5，前者表達水平低，持續時間短暫。在神經元中，核因子 NF-κB 可被 TGFβ1 通過 ALK1(TGF-βRⅠ)/Smad1/5介導激活，神經元核因子NF-κB又可上調Smad7的表達水平。我們知道生理狀態下Smad7阻礙Smad2/3的磷酸化，抑制TGFβ的信號傳遞。因此我們可以推測在神經元中Smad7可能抑制ALK5從而抑制Smad2/3的磷酸化，正由于Smad7的抑制，致使ALK5在神經元中低表達，ALK1高表達，其信號傳遞占優勢地位。由此認為，TGFβ1/ALK1/Smad1/5信號轉導路徑主要存在于神經元中并發揮神經保護作用［20-21］(如Fig 1)。② 同時研究發現，ALK5/Smad2/3主要存在于星形膠質細胞中，而ALK1/Smad1/5在星形膠質細胞中相對于前者表達水平低，持續時間短暫［20-21］。聯系上述實驗，TGF-βR介導TGF-β1被星形膠質細胞吸收產生癲癇樣放電，我們可以提出假設其機制可能是ALK5(TGF-βRⅠ)/Smad2/3介導TGF-β1或白蛋白在星形膠質細胞中產生作用被膠質細胞吸收而誘發癲癇樣放電。Wang等從30名顳葉癲癇患者腦組織檢測到TGF-βRⅠ的蛋白表達比對照組顯著增高，且利用免疫熒光技術發現TGF-βRⅠ主要聚集在星形膠質細胞細胞質中［22］。提示 TGF-β1激活的ALK5(TGF-βRⅠ)/Smad2/3信號轉導路徑在星形膠質細胞中的優勢地位及對癲癇的可能的促進作用。(如Fig 1)。在內皮細胞中，ALK5促進ALK1的表達，ALK1抑制 ALK5的信號傳遞，因而ALK1和ALK5兩者的傳導路徑之間相平衡［23］。由于TGFβ1生物學性質受細胞類型影響，由此我們可以推測在星形膠質細胞中可能與內皮細胞相反，ALK1促進ALK5的表達，ALK5抑制ALK1的信號傳遞，從而導致星形膠質細胞中ALK5高表達，其信號傳遞占優勢地位。

Fig 1 Signal transduction pathway of TGFβ1 in hippocampus and astrocyte

因此，TGFβ1信號傳導路徑對癲癇可能有著負面作用，尤其TGFβ1受體ALK5(TGF-βRⅠ)在星形膠質細胞中的作用可能會引發癲癇樣放電。而將谷氨酸受體激動劑NMDA作用于海馬培養細胞，K?nig等發現TGFβ1通過ALK1(TGF-βRⅠ)激活神經元核因子NF-κB發揮抗凋亡等神經保護作用［20］;TGFβ1還可通過上調星形膠質細胞PAI-l表達和抑制tPA引起的神經元鈣離子內流增加來保護神經元，并抑制神經細胞凋亡［14］。由此，TGFβ1對神經元細胞和星型膠質細胞產生的作用不同。既往研究已表明，TGFβ1的調節作用因細胞類型、刺激物和實驗條件不同而不同［2，17，24］。Ariane de Luca等報道TGFβ1誘導低劑量鉀離子培養的非成熟小腦顆粒細胞凋亡，在高劑量鉀離子培養的非成熟小腦顆粒細胞中則無作用［24］。但在復雜的癲癇神經網絡中，各種信號轉導路徑同處于一個有機整體，“癲癇耐受”的機制可能參與其中。

近些年來越來越多的研究發現TGF-β1在中樞神經系統疾病中的神經保護作用，可能會為TGF-β1和癲癇的研究提供一些新的思路。以期為癲癇的防治提供新策略，為尋找癲癇的藥物治療提供新靶點。

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