用RP－HPLC法測定鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠中鹽酸林可霉素的含量

施啟紅（江蘇省啟東市人民醫院藥劑科，啟東226200）

［本文編輯］蘭 芬

目前市售的鹽酸林可霉素制劑有片劑、膠囊劑和注射劑，其眼用制劑只有鹽酸林可霉素滴眼液。滴眼液在滴入眼后與角膜接觸的時間通常是1～2min，眼部生物利用度＜10%，需頻繁給藥，給病人帶來不便。溫敏凝膠是一種環境敏感型智能凝膠，在室溫下為液體，在體溫下轉變為凝膠［1，2］。鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠為江蘇省啟東市人民醫院的自制制劑，具有促進藥物透皮吸收，延長藥物作用時間等優點［3］，其主要成分為鹽酸林可霉素。測定鹽酸林可霉素含量最常用的方法是 HPLC法［4，5］，除此以外，還有分光光度法和微生物測定法等。《中華人民共和國藥典》2010版收載了鹽酸林可霉素片劑、注射液和膠囊，以及它們的質量控制方法，其他劑型尚未收載。本研究采用RP－HPLC法測定了鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠中鹽酸林可霉素的含量，可為其質量控制提供方法。

1 儀器和試劑

1.1 儀器LC－10AVP型HPLC儀，包括LC－10ATVP泵、SPD－10AVP紫外檢測器、Class VP色譜工作站和SCL－10AVP系統控制器（日本島津制作所）；Diamond C18色譜柱（美國迪馬公司）；DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省鞏義市英峪予華儀器廠）；DL－720A超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；TGL－16B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；FA－2004電子天平（上海天平儀器廠）；精密酸度計（上海天達儀器有限公司）。

1.2 試劑和藥品 鹽酸林可霉素對照品（純度99.5%，中國藥品生物制品檢定所，批號10773－0144）；泊洛沙姆407和泊洛沙姆188（美國BASF公司）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；其他試劑均為分析純。鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠（批號110311、110314、110317，含鹽酸林可霉素0.1%）和重蒸水由江蘇省啟東市人民醫院自制。

2 方法和結果

2.1 溶液的制備（1）對照品儲備液：精密稱取鹽酸林可霉素對照品2mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇適量溶解，并稀釋至刻度，得到濃度為200μg／ml的對照品儲備液，置于4℃冰箱中保存。（2）樣品溶液：取鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠1g，加10ml甲醇溶解，超聲30min，取該溶液1ml，置于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。將溶液移至EP管中，1.677×104×g離心5min，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液即得樣品溶液。（3）陰性對照溶液：制備不含鹽酸林可霉素的空白凝膠，按樣品溶液制備方法操作，即得陰性對照溶液。

2.2 色譜條件和系統適應性實驗 色譜柱：Diamond C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.05mol／L硼砂溶液（用磷酸調節pH 至7.4）－甲醇（50∶50）；流速：1.0ml／min；檢測波長：214nm；進樣量：20μl；柱溫為室溫。用甲醇將對照品儲備液稀釋，得到濃度為16μg／ml的對照品溶液，將該溶液與樣品溶液和陰性對照溶液分別進樣測定，得到色譜圖見圖1。由圖1可見，鹽酸林可霉素出峰時間約為16.5min，溫敏凝膠中其他成分對測定無干擾。

圖1 鹽酸林可霉素的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of lincomycin hydrochloride

2.3 標準曲線的繪制 精密量取2.1項下的對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4ml，分別置于10ml容量瓶中，用甲醇定容，得到系列濃度為2、4、8、16、24、32和48μg／ml的標準溶液。按2.2項下色譜條件進樣，測定峰面積（A）。以A對濃度（c）作線性回歸，得到標準曲線方程A＝9 471.6c－175.1（r＝0.999 9），表明鹽酸林可霉素在2～48μg／ml范圍內線性關系良好。

2.4 精密度實驗（1）日內精密度：取2.3項下低、中、高濃度為2、8、32μg／ml的對照品溶液各20μl，按2.2項下色譜條件，重復進樣3次，兩次進樣間隔3h，記錄峰面積，計算得到低、中、高濃度的日內RSD分別為1.40%、0.17%和0.28%（n＝3）。（2）日間精密度：取低、中、高濃度為2、8、32μg／ml的對照品溶液，每天測定1次，連續3d，記錄峰面積，計算得到低、中、高濃度鹽酸林可霉素的日間RSD分別為1.77%、0.84%和1.74%（n＝3）。

2.5 穩定性實驗 按2.1（2）項下的方法配制批號為110311的樣品溶液，在配制后的0、2、4、6、8h分別測定峰面積，計算得到RSD＝1.36%，表明樣品溶液在配制后8h內穩定［6］。

2.6 重復性實驗 取鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠樣品5份（批號110311），按2.1項下（2）制備樣品溶液，按2.2項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算得RSD＝1.98%（n＝5），表明該方法重復性良好。

2.7 回收率實驗 精密量取濃度分別為2、8、32μg／ml的鹽酸林可霉素對照品溶液0.5ml，加入適量已知濃度為9.78μg／ml的鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠樣品，以甲醇稀釋，按2.1（2）項下樣品溶液配制方法得到低、中、高濃度分別為11.608、17.584和41.501μg／ml的溶液，進樣測定。計算得到低、中、高濃度鹽酸林可霉素的回收率分別為（91.40±1.27）%、（97.55±0.93）%和（99.13±1.11）%（n＝3）。

2.8 樣品含量測定 取批號為110311、110314、110317的鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠樣品，按2.1（2）項方法制備樣品溶液，按2.2項下色譜條件測定含量。鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠中鹽酸林可霉素的標示量為0.1%，結果測得3個批號的樣品中鹽酸林可霉素的平均含量分別為標示量的（98.67±1.21）%、（99.90±0.44）% 和（99.28±1.17）%（n＝3），實際含量均在標示量的95%～105%范圍內，符合含量測定要求。

3 討 論

鹽酸林可霉素在高于60℃條件下不穩定，因此本研究對鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠的提取采用超聲提取后冷藏處理的方法。該方法既可以使鹽酸林可霉素提取完全，又可避免溫度過高對含量測定的影響，減少對色譜柱的污染。制備鹽酸林可霉素眼用溫敏凝膠要求pH值范圍是5～9，HPLC法測定時流動相體系中各成分的比例會影響其pH值，從而改變色譜圖峰形。因此，本研究在篩選流動相時參考文獻［4，5，7］做了一定的調整，最終確定以0.05mol／L的硼砂溶液（用磷酸調節pH 至7.4）－甲醇（50∶50）作為流動相。在該流動相下，鹽酸林可霉素出峰時間約為16.5min，與其他組分分離良好，峰形對稱。

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