杏鮑菇多糖對衰老模型小鼠學習記憶能力和腦組織抗氧化能力的影響①

姚冰薇，顧正峰，許波，李丹，練維，盛偉

杏鮑菇，別名刺芹側耳，學名Pleurotus eryngii(DC exFr.)Quel.，屬口蘑科，側耳屬。1970年，Henda在印度北部克什米爾高山上發現杏鮑菇；1974年，Cailleux用菌褶分離法獲得杏鮑菇菌株并試栽成功；1977年，Ferri首先進行商業性栽培[1]。杏鮑菇是一種很有發展前景的新型食用菌，也是聯合國世界糧農組織向世界各國推薦的食用菌新品。現代藥理學研究表明，杏鮑菇中所含的真菌多糖能增強機體免疫功能，具有抗病毒作用，且能降低機體膽固醇含量，防止動脈硬化[2]。杏鮑菇子實體入藥有降血壓、血脂的功效，其多糖含量豐富，與雙歧桿菌結合有改善腸胃功能和美容效果，多糖還具有抗癌效果。

楊立紅等報道杏鮑菇多糖對小鼠肝臟、骨骼肌有明顯的抗氧化、抗損傷作用[3]。張俊會等研究顯示，杏鮑菇多糖對自由基引起的亞油酸、菜油氧化以及離體肝臟組織的脂質過氧化均有一定的抑制作用[4]。本課題在杏鮑菇多糖體外抗氧化活性基礎上，利用D-半乳糖所致衰老小鼠模型，研究杏鮑菇多糖體內抗衰老與防治神經退行性變的生理活性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年ICR小鼠，雌雄各半，體重18～20 g，由南通大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 杏鮑菇菌株：安徽科技學院生命科學學院真菌研究所提供；腦復康片：揚州市星斗藥業有限公司(批號：120931)；D-半乳糖：上海生工生物工程有限公司進口分裝；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 杏鮑菇多糖的提取[5]杏鮑菇液體深層發酵培養，將發酵獲得的菌絲體烘干后粉碎，過40目篩得菌絲體干粉；加入15倍體積的蒸餾水，沸水浸提2 h，離心過濾，重復2次，合并上清提取液；提取液濃縮后用終濃度為75%乙醇沉淀24 h。離心后，將沉淀物用蒸餾水溶解，Sevag法除蛋白，濃縮醇析沉淀2次；乙醇洗滌2次，真空干燥，得杏鮑菇多糖制品。

1.3.2 衰老小鼠模型的建立[6]ICR小鼠72只，雌雄各半，分為6組：①低劑量組；②中劑量組；③高劑量組；④腦復康組；⑤模型組；⑥對照組。每組12只。①、②、③、④、⑤組小鼠頸背部皮下注射5%D-半乳糖0.25 ml/10 g，連續注射6周；其中①、②、③、④組小鼠于第3周分別灌胃給予杏鮑菇多糖2 g/kg、3 g/kg、6 g/kg及腦復康6.2 mg/10 g，⑤組小鼠給予等量雙蒸水；⑥組小鼠頸背部皮下注射等量生理鹽水并于第3周給予等量雙蒸水。

1.3.3 Y型迷宮測試[7]Y型迷宮為3等分輻射式反射箱。以小鼠被電擊后逃至安全區為正確反應，連續10次測試中有9次正確反應，定為學會。記錄各組小鼠達到學會標準的訓練次數。

1.3.4 器官指數測定 6周末將小鼠脫臼處死，取出心、肝、腎、腦，生理鹽水洗凈殘留血液后精確稱重，按公式計算臟器指數：

1.3.5 大腦SOD活性及MDA含量測定 取大腦組織，加入適量組織勻漿液，冰浴勻漿。Bradford法測定總蛋白含量。取1%大腦組織勻漿，用黃嘌呤氧化酶法(SOD檢測試劑盒)于波長550 nm處測定小鼠大腦組織勻漿的吸光度值。TBA比色法(MDA檢測試劑盒)于波長532 nm處測定小鼠大腦組織勻漿液的吸光度值。

1.3.6 大腦脂褐質含量測定 用Sohal法。稱取小鼠腦組織100 mg，加入氯仿、甲醇(2∶1)提取液2 ml，充分磨成勻漿，濾紙過濾，加提取液至5 ml，紫外線照30 s，于熒光分光光度計上測定其熒光強度值(發射波長435 nm，激發波長365 nm)。計算脂褐質含量：

1.3.7 大腦谷氨酸含量測定 稱取小鼠腦組織100 mg，0.61 mol/L三氯乙酸制作10%勻漿，取上清，石油醚-正丁醇洗后，點樣，電泳，茚三酮顯色后用雙波長薄層掃描儀測定全腦谷氨酸的含量。

1.4 統計學分析 采用Stata 11.0統計分析軟件對各實驗組與對照組間的差異進行t檢驗。

2 結果

2.1 Y型迷宮 與對照組相比，模型組小鼠達到學會標準訓練次數顯著增加(P＜0.001)；中、高劑量組訓練次數低于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組Y型迷宮訓練次數比較

2.2 器官指數 模型組肝、腦、腎的器官指數均較對照組顯著降低(P＜0.001)。高劑量組腦、腎器官指數較模型組升高(P＜0.05)。見表2。

表2 各組器官指數比較(mg/g)

2.3 SOD、MDA、脂褐質、谷氨酸 與對照組相比，模型組大腦組織SOD的活性明顯降低(P＜0.01)，MDA、脂褐質、谷氨酸含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，中、高劑量組SOD活性增加(P＜0.05)、MDA、脂褐質含量降低(P＜0.05)；高劑量組谷氨酸含量下降(P＜0.05)。見表3。

表3 各組SOD、MDA、脂褐質、谷氨酸比較

3 討論

D-半乳糖致衰老模型是基于衰老的代謝學說而復制的一種衰老模型，具有與自然衰老相似的自由基代謝紊亂特征，衰老反應接近于自然衰老[8]。

衰老過程中，全身組織器官逐漸萎縮，其中腦和腎臟的質量減輕最為顯著[9]。器官指數是反映生物體衰老程度的重要指標之一[10]。本研究顯示，模型組小鼠除心臟指數外，肝、腦和腎臟指數均比對照組顯著降低，高劑量杏鮑菇多糖能減輕腦和腎質量的增齡性下降，延緩腦、腎衰老過程。

D-半乳糖可在體內氧化產生大量自由基，引起脂質過氧化，導致細胞膜損傷；過氧化脂質(LPO)的分解終產物如MDA可與DNA或RNA及蛋白質和磷脂有關結構結合，使細胞膜結構改變，促進衰老；MDA等還可通過交聯、結合形成脂褐質，導致神經系統的障礙。SOD在保護心腦功能、延緩衰老方面具有重要的作用，SOD活性與物種壽命呈正相關。本研究顯示，模型組學習記憶力下降，大腦SOD活力降低，MDA含量升高，表現出明顯的衰老特征[11]。脂褐素沉積是衰老的一種標志，沉積程度與脂質過氧化反應正相關。脂褐素主要積累在大腦皮層和海馬，可破壞細胞磷脂膜結構，導致線粒體和粗面內質網減少以及空泡形成等，并使神經元數目減少，產生擬衰老變化[12]。

谷氨酸是中樞神經系統中一種重要的神經遞質。自然衰老動物腦中，谷氨酸含量增加，持續激活N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體，使細胞外Ca2+內流，細胞內Ca2+超載，產生大量的自由基，導致神經系統損傷。Poeggeler認為，谷氨酸的增多與衰老有密切聯系，其機制大致可概括：谷氨酸-自由基-衰老[13]。

盛偉等報道，杏鮑菇多糖提取物有較強的體外抗氧化性能，隨著濃度的增大其抗氧化作用亦增大[14]。對羥基自由基及超氧陰離子自由基的清除能力較強。

杏鮑菇是深受市場歡迎的食藥用真菌，對其真菌多糖的研究是目前杏鮑菇研究的重點。本研究顯示，杏鮑菇多糖能夠有效對抗D-半乳糖所致的小鼠亞急性臟器衰老和學習記憶能力的降低；機制可能是通過提高機體SOD等抗氧化酶活力，減少興奮性神經遞質谷氨酸的含量，從而對抗自由基對細胞的損傷，降低MDA、脂褐質等代謝產物的產生。

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