頭針對腦缺血再灌注大鼠腦微血管Ⅳ型膠原蛋白影響的動態研究*

于學平，孫曉偉，鄒 偉

(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040)

近年來腦缺血再灌注過程中血腦屏障(bloodbrain barrier，BBB)破壞已成為缺血再灌注損傷研究的一個熱點。腦微血管基底膜是BBB的重要結構之一，當BBB的結構或功能的完整性損傷、通透性增強時，往往以微血管基底膜損傷最為重要。頭針作為治療缺血性腦血管病的一種有效方法，其對腦缺血再灌注后BBB保護作用方面的研究甚少，而有關腦微血管基底膜中Ⅳ型膠原蛋白的相關研究更是未見報道，因此，本研究通過腦缺血再灌注大鼠模型，觀察頭針干預后不同時間點腦微血管基底膜Ⅳ型膠原蛋白的動態變化，以明確頭針治療腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

選取SD健康雄性大鼠130只(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)，體重280～300 g。隨機分為假手術組、模型組和針刺組。假手術組30只大鼠，其余兩組每組再隨機分為 MCAO2h/R4h、MCAO2h/R12h、MCAO2h/R24h、MCAO2h/R48h 和 MCAO2h/R72h等5個亞組，每個亞組10只大鼠，其中5只用來做免疫組化檢測，5只用來做ELISA檢測。

1.2 模型制備

參照改良的Zea Longa線栓法，制成大鼠右側大腦中動脈缺血2 h再灌注模型(MCAO/R)。術后大鼠左側肢體偏癱:提尾懸空時左上肢不能伸展或行進時向左側傾倒、向左側旋轉，表明造模成功。

1.3 干預方法

針刺組從百會穴進針，刺向右側曲鬢穴，進針約0.8寸，以200 r/min速度捻轉5 min，留針30 min，期間捻轉2次。假手術組和模型組大鼠，每天在針刺組治療時間內，均要抓取并固定1次，每次30 min，以保證與針刺組大鼠具有相同的飼養條件。

1.4 指標檢測

1.4.1 Ⅳ型膠原免疫組化測定 在相應時間點灌注處死大鼠，斷頭取腦，石蠟包埋。腦組織石蠟切片經脫臘、水化，3%H2O2抑制內原性過氧化物酶，1%牛血清白蛋白封閉，滴加ColIV一抗，4℃過夜。滴加生物素標記的二抗，37℃溫育30 min。滴加過氧化酶－鏈霉卵白素，37℃溫育30 min。DAB顯色液顯色。蘇木素復染、封片。

1.4.2 Ⅳ型膠原ELISA測定 在相應時間點處死大鼠，迅速斷頭取腦。將腦組織在冰浴中勻漿，提取蛋白。ELISA法檢測腦組織中Ⅳ型膠原含量的操作，嚴格按照試劑盒說明進行。

1.5 統計學方法

運用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05說明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間點各組大鼠缺血側腦組織Ⅳ型膠原免疫組化染色結果

在光學顯微鏡下，Ⅳ型膠原蛋白在各組大鼠腦組織中主要沿血管內壁呈陽性表達。假手術組:Ⅳ型膠原的表達豐富、連續，可見沿毛細血管內壁一周強陽性染色，在大血管中更為明顯。模型組:可見梗死灶周圍區的Ⅳ型膠原表達，與假手術組比較明顯減弱。再灌注4 h時血管扭曲變形，但Ⅳ型膠原沿血管的表達仍呈連續狀態;再灌注12 h，Ⅳ型膠原的表達明顯減弱，沿血管呈間斷表達;再灌注24～48 h，Ⅳ型膠原的表達降低最為顯著，僅沿血管呈少量散在點狀陽性染色;72 h組Ⅳ型膠原的表達量開始增加，連續表達與間斷表達Ⅳ型膠原的血管并存。頭針組大鼠在再灌注4 h、12 h梗死灶周圍區的Ⅳ型膠原表達與模型組相似;隨著針刺時間的延長和針刺次數的增加，再灌注24 h、48 h、72 h與模型組相比，梗死灶周圍區Ⅳ型膠原表達有所增加，但仍低于假手術組表達。

2.2 不同時間點各組大鼠缺血側腦組織Ⅳ型膠原蛋白表達的ELISA檢測結果

表1 3組大鼠缺血側腦微血管Ⅳ型膠原蛋白表達含量比較(±s)

表1 3組大鼠缺血側腦微血管Ⅳ型膠原蛋白表達含量比較(±s)

注:與相應時間點假手術組比較，△P＜0.05;與相應時間點模型組比較，★P＜0.05。

IR4h IR12h IR24h IR48h IR72h假手術組 3 0.97 ±0.04 0.92 ±0.03 0.90 ±0.04 0.90 ±0.03 0.組別 例數94 ±0.02模型組 5 0.86 ±0.02△ 0.79 ±0.04△ 0.53 ±0.01△ 0.49 ±0.02△ 0.59 ±0.02△針刺組 5 0.88 ±0.01△ 0.81 ±0.02△ 0.65 ±0.02△★ 0.58 ±0.02△★ 0.69 ±0.01△★

由表1可看出，大鼠腦缺血再灌注后的不同時間點缺血側腦微血管Ⅳ型膠原蛋白含量:模型組、頭針組均較假手術組明顯減低，具有顯著性差異(P＜0.05)。模型組大鼠在再灌注后4 h，缺血側腦組織中Ⅳ型膠原蛋白含量即明顯減低;且持續減少，至再灌注24～48 h，水平最低;隨后其含量開始升高，再灌注后72 h，其含量為0.59±0.02，但仍明顯低于假手術組(P＜0.05)。針刺組與模型組比較，頭針組大鼠在再灌注后各時間點缺血側腦組織中Ⅳ型膠原蛋白含量均有所升高，并逐漸增加，至再灌注后24 h、48 h、72 h升高最為明顯，與相應時間點的模型組相比，具有統計學意義(P ＜0.05)。

3 討論

血腦屏障(BBB)是位于腦組織與血液之間的一個屏障結構，主要由血管內皮細胞及其緊密連接(TJ)、血管基底膜和星形膠質細胞終足組成。腦缺血再灌注損傷可引起BBB破壞，而BBB破壞是導致缺血再灌注后腦水腫和炎癥反應等病理變化的重要環節[1]。基底膜作為毛細血管的支持結構，Ⅳ型膠原(ColIV)和層連蛋白(LN)是基底膜的主要成分，在這一病理過程中尤為重要。Hamann等發現局部腦缺血再灌注24 h后，腦微血管基底膜層連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅳ型膠原等表達均明顯減少，基底膜抗原也同步消失，說明腦缺血再灌注后存在腦微血管基底膜損害[2]。李玲等通過觀察腦缺血再灌注損傷過程中基底膜的動態變化，發現再灌注12 h至3天時，腦水腫和腦出血最為嚴重;再灌注12 h至7天，腦微血管基底膜大片脫落、溶解、缺損，Ⅳ型膠原與層連蛋白抗原明顯減少至消失，并與腦水腫、出血部位相一致。認為基底膜破壞的根本原因是Ⅳ型膠原、層連蛋白等成分的減少[3]。可見Ⅳ型膠原作為構成微血管基底膜的主要物質之一，是維持BBB完整性的重要結構基礎，尋求其有效的干預方法，對腦缺血再灌注損傷的防治將具有重要的臨床價值。

本研究采用改良的Zea Longa線栓法制備腦缺血/再灌注(MCAO/R)模型，運用免疫組化與 ELISA檢測方法，從蛋白定性及定量的不同角度，檢測缺血再灌注后不同時相點MCAO/R模型大鼠梗死區血管內壁Ⅳ型膠原陽性細胞表達的情況，兩種方法得出結論是一致的:缺血側腦組織中Ⅳ型膠原含量于再灌注4 h即開始減低，12 h明顯降低，24 h～48 h時降解達到高峰，隨后有所增加，此結果與筆者前期相關研究中所觀察到的腦梗死體積、腦水含量、BBB結構和通透性以及 MMP －9 的動態變化相一致[4～5]，從而證明了Ⅳ型膠原蛋白表達的減少與腦缺血再灌注后BBB的破壞和繼發性腦損害密切相關。

本研究發現針刺組大鼠再灌注后各時間點梗死灶周圍區Ⅳ型膠原的表達均較模型組增加;于再灌注后24 h、48 h、72 h，Ⅳ型膠原蛋白表達加強最為明顯，具有統計學差異(P＜0.05)。此結果與前期有關針刺與腦水含量及細胞外基質蛋白酶MMP－9的研究結果相吻合:針刺組大鼠在再灌注24 h、48 h、72 h，腦組織水含量較模型組顯著降低;再灌注各時間點頭針組大鼠缺血側腦組織 MMP－9表達較模型組顯著減少[4～5]。從而得出結論:早期進行頭針干預治療能上調缺血側腦組織中Ⅳ型膠原蛋白的表達，并隨著針刺治療時間的延長，其效果明顯提高，其機理可能與下調內源性MMP－9表達，減輕其對Ⅳ型膠原蛋白的降解有關。說明上調Ⅳ型膠原蛋白的表達，加強毛細血管基底膜的支持作用，保護BBB的完整性，可能是頭針治療腦缺血再灌注損傷的作用機制之一。

[1]海艦，丁美修.腦缺血再灌注時血腦屏障損傷的炎性機制[J].國外醫學·腦血管疾病分冊，2001，9(1):15－18

[2]Hamann GF，Okada Y，Fitridge R，et al.Microvascular basal lamina antigens disappear during cerebral ischemia and reperfusion[J].Stroke，1995，26:2120 －2126

[3]李玲，黃如訓，張小燕，等.局部腦缺血再灌注病灶區腦微血管基底膜及其成分改變的實驗研究[J].中華老年醫學雜志，2000，19(5):364－367

[4]孫曉偉，于學平，于春林，等.頭針對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障影響的實驗研究[J].針灸臨床雜志，2011，27(6):66 －69

[5]孫曉偉，于學平，李洪濤，等.頭針對腦缺血再灌注大鼠腦組織MMP－9表達調控的動態研究[J].中醫藥學報，2011，39(3):107－110