云南少數民族特發性全面性癲癇CLCN-2基因多態性研究☆

唐于荔 王文敏 俞志鵬

特發性全面性癲癇 （idiopathic generalized epilepsies，IGE）約占癲癇患者的 20% ～ 30%［1］多無明確發病原因，神經影像學檢查腦部無明顯的器質性改變，有一定年齡依從性、以兒童和青少年多見的一類全面性發作的癲癇。多年來，研究者進行癲癇發病機制的探討，發現遺傳因素在特發性癲癇中具有重要影響，編碼離子通道的基因突變是造成離子通道異常的原因［2］。目前鈉、鉀、鈣、氯離子通道與IGE相關性研究較為明確［3］。自Haug.K等［4］發現了涉及原發性全面性癲癇綜合征亞型的CLCN2基因突變后，人們不斷對此區域進行研究，發現了幾十種單核苷酸多態性［5-7］。2007年梁麗君等［8］首次對云南少數民族（基諾族）和漢族特發性全面強直-陣攣性癲癇與CLCN2基因相關性進行研究。此次我們增加樣本量，應用病例-對照方法首次研究云南省5個獨有少數民族（基諾族、阿昌族、布朗族、佤族、拉祜族）IGE與CLCN2基因中3個SNP 位點 rs2228291、rs6770808、rs6773786 之間 相關性，旨在為特發性全面性癲癇病因學提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 對象與分組 本研究中入選IGE患者的診斷主要根據1989年國際抗癲癇聯盟（IEAE）分類及命名委員會提出的癲癇及癲癇綜合征分類診斷標準確定發作類型，參閱流行病學病例確定標準及WHO在中國使用的癲癇調查問卷，入組標準為：①準確的病史和特征：患者有2次以上典型癲癇發作病史，可表現為全面性強直-陣攣性發作、兒童失神性癲癇、青少年肌陣攣性癲癇、青少年失神性癲癇等；②智力正常及除癇性發作外無其他神經病學體質；③抗癲癇藥物有效。排除標準為：①僅有熱性驚厥或新生兒抽搐不診斷為癲癇；②已明確由于腦部疾病急性期誘發引起的癇性發作不納入研究對象［9－10］。少數民族對照組為無癲癇病史的云南健康人群。

具體分組為：①少數民族病例組：包括上述5個少數民族共92例。基諾族患者為2005年10月至12月在云南省西雙版納傣族自治州入戶收集，阿昌族患者于2008年1月在德宏傣族景頗族自治州入戶收集，布朗族、佤族、拉祜族于2007年6月在臨滄地區入戶收集。②少數民族對照組：共170例，為同期收集的上述5個少數民族IGE患者的一級親屬。

1.2 方法 ①血樣采集及預處理：采集每位研究對象外周靜脈血2 mL放于EDTA抗凝管中，并加入等體積DNA保存液，－80℃低溫保存待用。②DNA提取：采用苯酚－氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA。③PCR反應：根據本實驗3個CLCN2多態性位點信息（見表1）設計引物。PCR反應總體積為20 μL，含基因組 DNA 1.5 μL，10X PCR Buffer（Mg2＋Free）2 μL，MgC12（12.5 mM）1.5 μL，Mixture（各 1.25 mM）1.5 μL，引物 1（up）（10 μM）0.1 μL，引物2 （down）（10 μM）0.1μL，rTaq DNA 聚合酶0.2 μL。 反應條件：94℃ 預變性 2 min，94 ℃變性20 s，Tm 退火 25 s，72℃ 延伸 30 s，35 次循環后 72℃延伸10min。④單堿基延伸（SNapshot）反應及測序測序膠圖經Applied Biosystem自帶的Sequencing Analysis 5.2分析軟件分析后轉化為測序結果，測序結果再用SeqMan軟件進行經手工校正無錯讀的序列成為原始數據。

1.3 統計學方法 將實驗原始數據錄入SPSS 17.0軟件數據庫并對其進行統計學處理。各組間進行遺傳平衡適合性檢驗，等位基因頻率（allele frequency）及基因型頻率（genotype frequency）的比較均采用卡方檢驗 χ2，檢驗水準 α ＝ 0.05。

2 結果

2.1 一般情況 少數民族病例組共92例，男57例，女35例。少數民族對照組共170例，男84例，女86例。

2.2 遺傳平衡檢驗 CLCN2基因SNP位點rs2228291、rs6770808在少數民族病例組及對照組處于 Hardy-Weinberg平衡狀態（P ＞ 0.05），位點rs6773786在少數民族病例組及對照組不處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P ＜ 0.05）。

2.3 病例－對照研究結果 3個SNP位點在少數民族病例組與對照組間基因型頻率獨立性檢驗：rs2228291、rs6770808、rs6773786 各位 點基因 型頻率在少數民族病例組與對照組間比較均沒有統計學意義（P ＞ 0.05）（見表 2）。

3個SNP位點在少數民族病例組與對照組間等位基因頻率檢驗：rs2228291、rs6770808、rs6773786各位點基因型頻率在少數民族病例組與對照組間比較沒有統計學意義（P ＞ 0.05）（見表3）。

3 討論

癲癇是一種常見的腦部疾病，在神經系統疾病中僅次于腦血管病變，頻繁發作可引起記憶、學習、行為等全面而廣泛的認知功能障礙，致傷、致殘甚至危及生命，嚴重影響患者健康和生存質量。由于特發性癲癇的致病原因不明，探討其發病機制對疾病的診斷、治療、預防顯得至關重要。自從Haug.K在特發性癲癇家系中發現了3種相關氯通道基因突變［4］，人們認識到電壓門控氯通道CLC?2與原發性癲癇關系密切，CLC?2通道缺陷可致癲癇發作。

表1 CLCN2基因中3個SNP位點PCR擴增片段與引物序列相關信息

表2 少數民族病例組與對照組間CLCN2基因SNP位點基因型頻率

表3 少數民族病例組與對照組間CLCN2基因SNP位點等位基因頻率

國外學者對CLCN2基因突變與IGE的發病機制進行廣泛研究，發現了CLCN2基因的數十種SNP改變，但研究結論不同。SNP（single nucleotide polymophism），即單核苷酸多態，是一種高效便捷的分子標記，更能反映個體特異性的特點。SNaP shot方法也稱小測序，通常用于10～30個SNP位點分析，主要針對中等通量的SNP分型項目。

云南省是我國少數民族最多的省份，其豐富的少數民族資源、族內通婚習俗、居住相對集中、長期處于隔離或相對隔離狀態、受外界影響相對較小等特點均有利于進行疾病的遺傳學研究。本實驗采用SNaP shot方法檢測CLCN2基因多態性位點 rs2228291、rs6770808、rs6773786 是否與云南少數民族特發性全面性癲癇相關。

一般資料統計再次證實云南省5種少數民族IGEs發病年齡仍多在20歲之前，與目前流行病學調查研究結論相似［10-11］。本次研究rs2228291、rs6770808位點無論在少數民族病例組還是對照組均處于遺傳平衡狀態，說明樣本代表性較好，符合遺傳平衡狀態。而rs6773786位點在少數民族病例組及對照組不符合Hardy?weinberg遺傳平衡定理。分析其原因可能是：采樣不是隨機進行或和原發性全面性癲癇疾病相關。維持群體的遺傳平衡需要一定的條件，或者說這種遺傳平衡受一些因素的影響，例如群體要很大，必須是隨機交配而非選擇交配，不會因遷移而產生群體結構的變化等。CLCN2基因多態性位點 rs2228291、rs6770808、rs6773786 檢測中云南少數民族病例組與對照組基因型頻率、等位基因頻率比較均無統計學差異（P＞0.05），說明上述3個CLCN2基因多態性位點與云南5種少數民族—基諾族、阿昌族、布朗族、佤族、拉祜族人群IGE可能無顯著相關性。

本實驗與既往研究有相似之處，也有不同，推測造成的原因可能是：①本實驗研究對象針對云南五種少數民族IGE患者及其對照人群，可能存在種族差異性；②因各民族樣本量少而合并成少數民族病例組可能對實驗結果分析有一定影響；③本實驗針對特發性全面性癲癇，且患者多表現為特發性全面強直-陣攣性癲癇，臨床表型相對單一，可能致使研究結論的不同；④上述三個SNP位點位于CLCN2基因不同區域，而且每個基因SNP位點的作用有限，存在多個基因共同作用的可能，在重復性研究中可能會出現與既往研究報道不符的情況。

本研究探討了云南少數民族人群IGE的可能發病機制，在后續研究中有必要擴大少數民族樣本數量及癲癇發作類型進行SNP位點的功能研究、檢測大樣本全基因序列、多位點構成的單體型分析、異常蛋白質產物功能檢測等工作，以早日闡明癲癇發病機制與遺傳因素的關系，特別是IGE與基因突變之間的聯系，在臨床上對特發性癲癇的基因診斷及轉基因治療提供依據。

［1］Sander JW.The epidemiology of epilepsy revisited ［J］.Curr Opin Neurol，2003，16（2）：165-170.

［2］Gutierrez?Delicado E，Serratosa JM.Genetics of the epilepsies［J］.Curr Opin Neurol，2004，17（2）：147-153.

［3］馬磊，江文，史明，等.新生兒癲癇的發生機制及對發育腦的影響［J］.中國神經精神疾病雜志，2011，37（4）：249-251.

［4］Haug K，Warnstedt M，Alekov AK，et al.Mutations in CLCN2 encoding a voltage?gated chloride channel are associated with idiopathic generalized epilepsies［J］.Nat Genet，2003，33（4）：527-532.

［5］Everett K，Chioza B，Aicardi J，et al.Linkage and mutational analysis of CLCN2 in childhood absence epilepsy［J］.Epilepsy Res，2007，75（2-3）：145-153.

［6］D′Agostino D，Bertelli M，Gallo S，et al.2004.Mutationsand polymorphisms of the CLCN2 gene in idiopathic epilepsy［J］.Neurology，2004，63（8）：1500-1502.

［7］Stogmann E，Lichtner P，Baumgartner C，et al.Mutations in the CLCN2 gene are a rare cause of idiopathic generalized epilepsy syndromes［J］.Neurogenetics，2006，7（4）：265-268.

［8］梁麗君，常履華，任惠，等.云南基諾族及漢族IGTCS與CLCN2基因相關性研究［J］.中華神經科雜志，2007，40（11）：741-745.

［9］中華神經科雜志編輯部.國際抗癲癇聯盟分類和名詞委員會推薦的癲癇和癲癇綜合征的分類（1989）［J］.中華神經科雜志，2001，34（3）：187.

［10］任惠，俞志鵬，王文敏，等.中國云南基諾族癲癇流行病學調查［J］.國際神經病學神經外科學雜志，2007，34（1）：10-12.

［11］俞志鵬，唐艷湘，王文敏，等.中國云南佤族人群癲癇流行病學調查［J］.中華流行病學雜志，2009，30（1）：95-96.