骨肽對骨髓間充質干細胞TGF－β1表達的影響

王維剛，王志剛，李大鵬

（吉林醫藥學院附屬465醫院，吉林 吉林132013）

骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來源于骨髓的具有多向分化潛能的成體干細胞，可在體外培養，具有自我更新能力；在一定的誘導條件下，MSCs具有向成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、脂肪細胞等多向分化的能力［1］。同時因其具有取材方便，易于分離培養，體外擴增快，且自體骨髓干細胞移植不易產生免疫排斥等優點而備受重視，成為組織工程、細胞治療、基因治療等領域的研究熱點。

本實驗研究骨肽對體外培養MSCs不同時間點TGF－β1表達的影響，初步探討骨肽在促進 MSCs成骨分化的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠購自吉林大學動物實驗中心。

1.2 主要試劑 DMEM－L培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）；Percoll（密度1.073g.mL－1，Pharmacia）；骨 肽 （黑 龍 江 江 世 藥 業 有 限 公 司）TGF－β1 ELISA試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 MSCs培養與鑒定參考已發表的文章［2］，將分離獲得的第三代MSCs用含10%胎牛血清的DMEM－L，置于培養箱中，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養。

1.3.2 骨肽對MSCs表達的影響 待MSCs融合至85%，胰酶消化，計數活細胞以每孔1×106接種于24孔板中，培養24小時后，加入不同濃度的骨肽（0.002mg／ml、0.008mg／ml、0.032mg／ml），對照組加入基礎培養基。分別在1d、3d、5d、7d利用ELISA法檢測細胞培養液中TGF－β1的含量。

2 結果

與對照組相比，骨肽濃度為0.002mg／ml時，細胞上清中TGF－β1含量有無明顯改變。隨著骨肽濃度增高，TGF－β1的表達含量有增高的趨勢，0.008mg／ml組與對照組有統計學差異P＜0.05；0.032mg／ml劑量組與對照組相比時 TGF－β1增高更加明顯，統計學有顯著性差異（P＜0.01）。0.008 mg／ml和0.032mg／ml劑量組培養5d、7dTGF－β1含量與1d、3d相比有下降趨勢。

表1 不同劑量、不同時間骨肽對MSCs TGF－β1含量的影響（±s）

表1 不同劑量、不同時間骨肽對MSCs TGF－β1含量的影響（±s）

與對照組相比＊P＜0.05，ΔP＜0.01；

骨肽（mg／ml）1in MSCs 1（t／d） 3（t／d） 5（t／d） 7（t／d）TGF－β對照組0.18±0.02 0.18±0.01 0.19±0.02 0.18±0.00 0.002 0.20±0.01 0.22±0.02 0.21±0.02 0.22±0.00 0.008 0.33±0.01＊0.35±0.03＊0.29±0.02＊ 0.30±0.02＊0.032 0.48±0.02Δ 0.45±0.02Δ 0.39±0.03Δ 0.40±0.01Δ

3 討論

MSCs的多向分化潛能及其體外增殖力強，大量傳代培養后仍具有很強的成骨能力等優點成為骨組織工程的首選種子細胞。以往研究表明，MSCs的定向分化成骨仍是通過外部物質進行誘導，誘導劑使用大多是激素、細胞因子之類［3－5］，開發新型安全有效的MSCs成骨分化誘導劑，具有良好的應用價值。

TGF－β可由成骨細胞產生并以自分泌的形式對成骨細胞的復制和基質的合成起雙向調節作用，尤其TGF－β1是骨骼中重要的傳導物質之一［6］。既往的實驗研究表明TGF－β1能促進骨膜間充質細胞增殖和分化，促進骨細胞增殖；且TGF－β1還能增加成骨細胞定向遷移的能力，這在骨再建過程中吸收成骨細胞前祖向激活的骨吸收部位移動，有重要的趨化作用，骨微環境中潛在的TGF－β1激活對于調節控制骨再建過程中有十分重要的作用［7］。

骨肽是從中經高科技生物技術精制提取的一種新型骨病治療藥物，內含有多種與骨代謝有關的生長因子及鈣、磷等元素，具有廣泛的生物學活性，在體內可參與骨鈣的吸收和釋放，調節骨代謝的平衡，促進骨痂和新血管的形成，因此在臨床上廣泛應用于骨折和骨折疏松的治療。

本實驗采用ELISA方法檢測骨肽作用后MSCs細胞上清中 TGF－β1蛋白含量變化，發現0.002mg／ml組與對照組相比，各時間段 TGF－β1蛋白無明顯改變，而0.008mg／ml和0.032mg／ml兩組各時間段表達明顯增強，而且0.032mg／ml劑量組TGF－β1表達量與0.008mg／ml相比有增高趨勢。此結果顯示，在各時間段骨肽對MSCs TGF－β1的表達從無明顯作用到刺激增強，提示骨肽影響MSCs TGF－β1的表達具有劑量依賴效應。在本研究中，0.008mg／ml和0.032mg／ml兩個劑量組在5d和7d兩個時間點TGF－β1表達量與1d和3d比較有下降趨勢，考慮與在3d時已經有足夠的TGF－β1表達并啟動下游信號分子引導 MSCs分化，或者與在此時間MSCs已達到最大增殖并有部分發生凋亡有關，有關這部分機制研究需要進一步探討。

［1］Premjit Arpommaeklong，Shelley E，Brown，Zhuo Wang，et al.Phenotypic characterization，osteoblastic differentiation and bone regeneration capacity of human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells Dev，2009，18（7）：1.

［2］郭新，趙東海，何旭，等.大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養［J］.吉林大學學報（醫學版），2005，31（3），469.

［3］Oreffo RO，Triffitt JT.Future potentials for using osteogenic stem cells and biomaterials in orthopedics［J］.Bone，1999：25（2 supply）：5.

［4］Maniatopoulos C，Sodek J，Melcher A H，Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats［J］.Cell Tissue Res，1988，：254（2）：317.

［5］Gronthos S，Zannettino A C，Hay Sjpurified，et al.Molecular and cellular characterization of highly stromal cells derived from human bone marrow［J］.J Cell Sci halford K W，2003，116（9）：1827.

［6］Choi EM，Suh KS，Kim YS，et al.Soybesb ethanol extract increases the function of osteoblastic MC3T3－E1cell［J］.Phyto chemismtry 2001，56（7）：733.

［7］Randy N，Rosier M D，Ragis J，et al.The potential role of transforming growth factor bata in fracture healing［J］.Clin Orthop ＆ Res，1998，355：294.