細胞色素2J3基因轉染對大鼠胸主動脈球囊損傷后血管狹窄程度的影響及其機制探討＊

宗 哲 付 研 李大鵬 程 晉 王 磊 李建中 常 靜 張立克

血管介入是治療外周血管阻塞性疾病和心腦血管疾病的常用方法，但術后血管再狹窄（Restenosis，RS）是臨床應用中的主要問題。由于術后RS的形成是多因素、多環節參與的復雜過程，因此調動機體內源性抗RS的多種機制，對預防RS，尤其是術后遠期RS非常重要。

近年來，細胞色素P450／環－二十碳三烯酸（Cytochrome P450／Epoxyeicosatrienoic Acids，CYP450／EETs）對血管的多環節作用引起人們的重視。人血管內皮細胞及平滑肌細胞中存在著CYP450的亞型2J2（CYP2J2），而大鼠血管內皮細胞及平滑肌細胞中存在的主要是2J3（CYP2J3），它們可催化花生四烯酸（Arachiodonic Acid，AA）生成11，12－環－二十碳三烯酸（11，12－Epoxyeicosatrienoic Acids，11，12－EET）等。

本文通過觀察CYP2J3基因轉染對實驗大鼠胸主動脈球囊損傷后RS的影響，分析CYP2J3／EET系統與血管損傷后RS的關系，為闡明血管損傷后RS的發生機制，以及基因療法在介入治療術后RS的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性 Wistar大鼠36只，體重280～300g，由軍事醫學科學院動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK－（軍），NO：0059020；Western blotting發光試劑盒、BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）；總RNA提取及反轉錄試劑盒（美國Promega公司）；Taq Platinum PCR MasterMix及無內毒素質粒大量提取試劑盒（天根公司，中德合資）；DNA Marker及蛋白預染Marker（中國全式金公司）；無水乙腈（Anhydrous Acetonitrile）；96%甲酸（Formic Acid，美國 Sigma公司）；N，N－diisopropylethylamine（美國 Sigma公司）；固相萃取柱（Solid Phase Eextraction，SPE）（美國 Waters公司）；pcDNA3.1－CYP2J3質粒由首都醫科大學病理生理教研室實驗室構建；余各試劑均為市售分析純產品；PCR引物由上海生工合成，內參β－actin上下游引物分別為：5’－ACC TAT CCC TTC AGC AGT TTG TG－3’，5’－TGG TAG GCT TCC TCT TGT ATT CG－3’，擴增產物大小為450bp；CYP2J3上下游引物分別為5’－ACC TAT CCC TTC AGC ATT TGT G－3’，5’－TGG TAG GCT TCC TCT TGT ATT CG－3’，擴增產物大小為300bp。

1.2 重組pcDNA3.1－CYP2J3質粒的提取和純化

將前期構建成功的真核表達質粒PcDNA3.1－CYP2J3，分別經KpnI、NotI雙酶切鑒定后，用無內毒素質粒大量提取試劑提取。紫外分光光度計（Eppendorf）檢測提取質粒純度 A260／A280≈1.8，濃度約1g／L。

1.3 實驗分組及處理

大鼠飼養1周后，首先建立胸主動脈球囊損傷模型［2］（18只），于制模同時隨機分為三組（每組6只），分別從鼠尾靜脈注入生理鹽水（動脈損傷鹽水組）、CYP2J3重組質粒組（動脈損傷2J3組）及pcDNA3.1（動脈損傷3.1組），3ml／kg體重；另選18只實驗大鼠亦隨機分為三個假手術組，除不進行胸主動脈球囊損傷外，其它處理同上三組，分別為假手術鹽水組、假手術2J3組和假手術3.1組，每組6只。術后第28天采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，快速摘取胸主動脈，經生理鹽水沖洗，剝離干凈血管周圍結締組織后分別用0.01%DEPC水沖洗3遍后，取0.5cm～1.0cm段置于10%中性福爾馬林中固定至少24h備用；取1.5cm～2.0cm段置于液氮或者深低溫冰箱備用。

1.4 胸主動脈相對管腔面積（Rrelative Luminal Area，RLA）測定

取中性福爾馬林固定24h的胸主動脈標本，經脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色后鏡下觀察。按照組織學劃分血管內膜（內彈力膜以內）、血管中膜（內、外彈力膜之間）和血管外膜（外彈力膜以外）。在4倍物鏡下將完整的血管橫切面HE染色圖像攝入計算機圖像分析系統中進行圖像編輯，用鼠標準確勾畫出外彈力膜、內彈力膜以及管腔的輪廓，計算管腔面積（Lumenaera，LA），每張切片測3次，取平均值。以LA與內膜、中膜和LA之和的比值為RLA。

1.5 胸主動脈CYP2J3mRNA表達水平測定

自液氮中取出胸主動脈標本加入冷裂解液中，快速勻漿，經氯仿和異丙醇抽提、75%乙醇漂洗，室溫干燥后得到RNA，加入DEPC水溶解。提取RNA作為PCR模板，采用RT－PCR法檢測細胞CYP2J3mRNA表達，以其吸光度值與β－actin吸光度值的比值表示。

1.6 胸主動脈11，12－EET 含量檢測

自液氮中取出胸主動脈標本，11，12－EET檢測標本制備：20mg組織置于200μl甲醇和0.4μl甲酸中低溫超聲勻漿，提取上清液進行衍生，產物經氬氣吹干后溶解于30μl無水乙腈中，置于－80℃深低溫冰箱中保存。采用高效液相色譜法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC，安捷倫公司提供高效液相色譜分析系統）檢測其11，12－EET 含量［8］。標準品為11，12－EET，層析柱為 Agilent公司SBC18，流動相：A相為0.5%甲酸水溶液，B相為0.5%甲酸乙腈溶液，流速1ml／min，層析條件：前40min B相濃度由50%增至65%，其后80min B相濃度由65%增至100%，最后以B相100%維持20min。11，12－EET色譜峰值出現在第85min左右。

1.7 統計學處理

采用SPSS13.0數據處理系統進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（s）表示。各組間計量資料的比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），差異顯著，則采用最小顯著差（Least Significant Difference，LSD）法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組RLA

假手術組2J3基因轉染及單純PC3.1質粒對動脈環RLA無明顯影響（P＞0.05），而胸主動脈損傷使RLA減小（P＜0.05或P＜0.01）；但動脈損傷2J3組RLA明顯大于動脈損傷鹽水組及動脈損傷3.1組（P＜0.01），提示CYP2J3基因轉染可減輕動脈損傷后血管狹窄的程度（圖1）。

圖1 各組大鼠胸主動脈相對管腔面積比較（s，n均＝6）

2.2 各組CYP2J3mRNA表達

假手術2J3組CYP2J3mRNA表達高于假手術鹽水組及假手術3.1組（P＜0.05），表明轉染成功；胸主動脈損傷各組CYP2J3mRNA均表達上調，尤以動脈損傷2J3組CYP2J3mRNA表達更高于動脈損傷鹽水組及3.1組（P＜0.01），提示CYP2J3基因轉染后動脈損傷使CYP2J3mRNA表達進一步提高（圖2）。

圖2 各組大鼠胸主動脈CYP2J3mRNA表達水平比較（s，n均＝6）

2.3 各組11，12－EET 含量

三個假手術組之間11，12－EET水平差異無統計學意義，說明基因轉染對正常胸主動脈11，12－EET水平無顯著影響；胸主損傷各組11，12－EET水平明顯升高（P＜0.01），而動脈損傷2J3組高于動脈損傷鹽水組及3.1組（P＜0.01），說明CYP2J3基因轉染可使損傷動脈11，12－EET水平進一步提高（圖3）。

圖3 各組大鼠胸主動脈11，12－EET水平（s，n均＝6）

3 討 論

CYP450單氧化酶可催化AA生成四種EETs：5，6－；8，9－；11，12－；14，15－EETs［1］。作為內皮衍生性超極化因子（Endothelium Derived Hyperpolarizing Factor，EDHF）的 EETs具有舒張血管［4］、抗血栓形成［5］、促進血管內皮細胞增殖［6］等多種血管保護作用。近年研究發現，EETs還與血管發生有關［7］。研究者還發現，11，12－EET 作為內源性物質具有拮抗缺血／再灌注損傷的心臟保護作用及拮抗內皮細胞缺氧／復氧損傷作用［8］；常氧下 11，12－EET拮抗血管平滑肌細胞增生及遷移，缺氧下抑制血管平滑肌細胞增殖和促進其凋亡等多種血管保護作用［9］。

經皮冠狀動脈腔內成形術（PTCA）是目前治療冠心病的最為有效的方法之一，但術后6個月內30～45%的RS嚴重影響了PTCA的臨床療效［10］。雖然隨后支架置入術應用其中，但支架置入術后RS發生率仍為32～35%［11］，使PTCA的遠期療效受到了很大限制，因此RS的防治成為目前心血管病防治研究的重要課題。有研究認為，RS是動脈損傷的愈合過程，有血管彈性回縮、血小板沉積，血栓形成、炎癥反應、基質沉積、血管重塑、血管平滑肌細胞（VSMC）遷移、表型轉化、過度增殖和凋亡減少等多種因素參與，其中內皮細胞損傷是RS的始動因素。目前，為防治PTCA術后RS發生的措施主要包括藥物治療、介入治療、安放藥物洗脫支架和基因治療。其中基因治療是當前研究的熱點，也是防治PTCA術后RS的一種新方法。

本實驗通過靜脈直接注射裸質粒的方法導入CYP2J3重組質粒，發現假手術2J3組CYP2J3mRNA表達高于假手術鹽水組及3.1組，表明轉染成功；但假手術2J3組、假手術鹽水組及3.1組11，12－EET水平差別無顯著性，提示CYP2J3基因轉染未損傷動脈。本研究還發現，損傷胸主動脈可提高其CYP2J3mRNA表達，同時提高11，12－EET水平，而動脈損傷2J3組不僅CYP2J3mRNA表達高于假手術2J3組及動脈損傷鹽水組，其11，12－EET水平也是如此。提示胸主動脈損傷可能使轉染的CYP2J3基因發揮作用而生成11，12－EET。

對未損傷動脈大鼠進行CYP2J3基因轉染及注射pcDNA3.1質粒未引起動脈的RLA明顯變化，但胸主動脈損傷則使RLA減小。CYP2J3基因轉染胸主動脈損傷大鼠的RLA明顯大于動脈損傷鹽水組及3.1組，表明CYP2J3／EETs系統上調緩解了動脈損傷后狹窄，提示CYP2J3／EETs系統上調可能是動脈損傷后防止血管狹窄的重要機制。

動脈損傷后，再狹窄的形成是一個多因素、多環節共同作用的復雜問題，無論是發病機制和防治措施仍然存在許多疑點和難點，有待于更深層次的研究。

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