血管生成素1，2通過(guò)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶調(diào)節(jié)失血性休克大鼠血管低反應(yīng)性＊

徐 競(jìng) 藍(lán) 丹 李 濤 楊光明 劉良明

休克后血管反應(yīng)性呈早期增高和晚期降低的雙相變化［1］，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素－1（Angiopoietin－1，Ang－1）、血管生成素－2（Angiopoietin－2，Ang－2）在失血性休克后大鼠腸系膜上動(dòng)脈（Superior Mesenteric Artery，SMA）中呈時(shí)間上的差異表達(dá)，并通過(guò)Tie－2受體參與失血性休克血管反應(yīng)性雙相變化的形成［2］，蛋白激酶B（PKB／Akt）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38Mitogen－Activated Protein Kinase，p38MAPK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular Signal Regulated Kinase，Erk）幾種分子參與了調(diào)節(jié)過(guò)程，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。

根據(jù)基礎(chǔ)研究，Ang－1和Ang－2激活血管內(nèi)皮細(xì)胞（Vascular Endothelial Cell，VEC）上的 Tie－2受體之后，可經(jīng)磷脂酰肌醇3－激酶（Phosphatidylinositol 3－Kinase，PI3K）激活A(yù)kt，還可經(jīng)過(guò)銜接蛋白Grb2活化p38MAPK和Erk，再通過(guò)激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）產(chǎn)生一氧化氮（Nitric Oxide，NO）［3，4］，NO是目前已知的一種對(duì)血管舒縮反應(yīng)性有重要調(diào)節(jié)作用的分子［5］。那么 Ang－1和 Ang－2能否通過(guò) Akt、p38MAPK和Erk激活iNOS產(chǎn)生NO來(lái)調(diào)節(jié)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性的雙相變化即成為有重要意義的研究課題。本實(shí)驗(yàn)采用離體微血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)和Western Blotting方法，觀(guān)察實(shí)驗(yàn)大鼠失血性休克后不同時(shí)間點(diǎn)SMA中iNOS蛋白表達(dá)變化、iNOS抑制劑對(duì)Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應(yīng)性的影響以及給予Ang－1和Ang－2、Tie－2、Akt、p38MAPK、Erk 等 的 抑 制 劑 后 缺 氧VEC和血管平滑肌細(xì)胞（Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC）中iNOS蛋白表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量的變化，以探討iNOS在Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)休克血管反應(yīng)性雙相變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞準(zhǔn)備

采用第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重200～230g，戊巴比妥鈉（0.1ml／100g體重）腹腔注射麻醉。

根據(jù)文獻(xiàn)［6］進(jìn)行VEC和VSMC原代細(xì)胞培養(yǎng)，取第3代至第5代的VEC和VSMC細(xì)胞，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)1∶1比例進(jìn)行混合培養(yǎng)，次日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

Ang－1、Ang－2、iNOS 抗 體、Akt抑 制 劑 VIII trifluoroacetate salt hydrate、Erk抑制劑PD98059、p38MAPK抑制劑SB203580均購(gòu)自美國(guó)Sigma－Aldrich公司，Tie2阻斷抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，iNOS抑制劑L－NIL hydrochloride購(gòu)自英國(guó)Tocris公司，NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Calbiochem公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（1）取大鼠48只，麻醉后右側(cè)股動(dòng)脈插管接血壓計(jì)［7］，隨機(jī)將其中8只作正常對(duì)照，其余40只分為休克10min、30min、1h、2h、4h組，每組8只，經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈放血使平均動(dòng)脈壓（Mean Artery Pressure，MAP）降至40mmHg，并維持不同時(shí)間，制作不同休克時(shí)間的失血性休克模型［7］。休克完成后將大鼠斷頭處死，取SMA組織測(cè)定iNOS的蛋白表達(dá)。

（2）另取大鼠104只，麻醉后將大鼠斷頭處死，分離SMA一級(jí)分支動(dòng)脈血管，切割成長(zhǎng)2.5mm的血管環(huán)（直徑10～100μm），隨機(jī)分為13組：正常對(duì)照組、缺氧10min組；Ang－1＋缺氧10min組、Ang－2＋缺氧10min組；iNOS抑制劑＋缺氧10min組、iNOS抑制劑＋Ang－1＋缺氧10min組、iNOS抑制劑＋Ang－2＋缺氧10min組；缺氧4h組、Ang－1＋缺氧4h組、Ang－2＋缺氧4h組；iNOS抑制劑＋缺氧4h組、iNOS抑制劑＋Ang－1＋缺氧4h組、iNOS抑制劑＋Ang－2＋缺氧4h組，每組8只血管環(huán)。實(shí)驗(yàn)采用Ang－1、Ang－2濃度均為200ng／ml，iNOS抑制劑濃度為1×10－4mol／L。缺氧處理方法［6］：將血管浸入無(wú)糖 Krebs－Henseleit（K－H）液，置于缺氧罐中，充入缺氧氣體（5%CO2和95%N2）15min后夾閉導(dǎo)氣管10min，反復(fù)5次，最后一次充氣后，按各實(shí)驗(yàn)組要求分別夾閉10min或4h完成缺氧。最后測(cè)定血管反應(yīng)性。

（3）取培養(yǎng)的VEC和VSMC混合細(xì)胞32瓶，隨機(jī)分為8組：正常對(duì)照組、缺氧4h組、Ang－2＋缺氧4h組、Tie－2抑制劑＋缺氧4h組、Akt抑制劑＋缺氧4h組、p38MAPK抑制劑＋缺氧4h組、Erk抑制劑＋缺氧4h組、iNOS抑制劑＋缺氧4h組，每組4瓶。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將細(xì)胞培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，Ang－1和 Ang－2濃度均為200ng／ml，Tie－2阻斷抗體1：100，Akt抑制劑1×10－5mol／L、p38MAPK 抑制劑1×10－5mol／L，Erk抑制劑1×10－5mol／L，iNOS抑制劑1×10－4mol／L。缺氧處理方法同（2），完畢后取細(xì)胞培養(yǎng)上清測(cè)定NO含量，收集細(xì)胞測(cè)定iNOS蛋白表達(dá)。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 血管反應(yīng)性測(cè)定：將SMA一級(jí)分支血管環(huán)固定于微血管肌動(dòng)描記儀，浸入K－H液，采用累積濃度法檢測(cè)微血管環(huán)對(duì)梯度濃度去甲腎上腺素（NE）的反應(yīng)性，作量－效曲線(xiàn)，曲線(xiàn)擬合法求NE的最大收縮力（Emax），以 NE的Emax評(píng)價(jià)血管反應(yīng)性［8］。

1.4.2 iNOS蛋白表達(dá)：取SMA組織或細(xì)胞，提取總蛋白，常規(guī)Western Blotting方法檢測(cè)蛋白條帶，采用8%SDS－PAGE膠，iNOS抗體滴度1∶10 000，Quantity One軟件分析蛋白條帶，以iNOS／β－actin光密度比值反映iNOS蛋白表達(dá)。

1.4.3 NO含量測(cè)定：取VEC和VSMC的細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用硝酸還原酶法測(cè)定NO含量，檢測(cè)步驟按照NO檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 失血性休克后不同時(shí)間iNOS的蛋白表達(dá)變化

iNOS在正常對(duì)照組表達(dá)很低（與β－actin的比值均數(shù)為0.0694），失血性休克30min后iNOS表達(dá)逐漸增高，休克30min、1h、2h和4h組均數(shù)分別增高至0.1469、0.1984、0.2595和0.2489 （P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 失血性休克后iNOS的蛋白表達(dá)變化

2.2 iNOS抑制劑對(duì)Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應(yīng)性的影響

iNOS抑制劑對(duì)離體SMA缺氧早期（10min）的血管高反應(yīng)性及Ang－1、Ang－2對(duì)其的作用無(wú)顯著影響，但可恢復(fù)缺氧晚期（4h）的血管低反應(yīng)性，NE的Emax均數(shù)由5.875mN增高至8.937mN （P＜0.01）；還可以抑制Ang－2進(jìn)一步降低血管反應(yīng)性的作用，NE的Emax均數(shù)由3.444mN增高至7.492mN（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

2.3 Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧晚期血管低反應(yīng)性時(shí)iNOS蛋白表達(dá)和NO含量變化

培養(yǎng)VEC和VSMC混合細(xì)胞缺氧4h組的iNOS蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高（P＜0.01），Ang－1、Tie－2抑制 劑、p38MAPK 抑 制劑 和 Erk 抑制劑可顯著抑制其增高，使其光密度比值均數(shù)由缺氧4h的0.2841分別降低至0.0790、0.0924、0.0793和0.0899（P＜0.01）；Akt抑制劑對(duì)其無(wú)顯著影響。見(jiàn)圖3。

圖2 iNOS抑制劑對(duì)Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應(yīng)性的影響

圖3 Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧晚期血管反應(yīng)性時(shí)iNOS蛋白表達(dá)變化

混合VEC和VSMC培養(yǎng)上清液中NO含量在缺氧4h組較正常對(duì)照組顯著增高，（30.5941vs 0.8923 μmol／108細(xì)胞，P＜0.01），Ang－1，Tie－2、Akt、p38MAPK、Erk、iNOS抑制劑均可抑制其增高，使其分別降低至15.2079、9.3667、20.0924、14.9076、13.9129和13.0048μmol／108細(xì)胞 （P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧晚期血管反應(yīng)性時(shí)NO含量變化

3 討 論

研究顯示，Ang－1和Ang－2激活VEC上的Tie－2受體之后，可經(jīng)Akt、p38MAPK和Erk調(diào)節(jié)iNOS活性和 NO 產(chǎn)生［3，4］；還有報(bào)道，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)內(nèi)毒素休克的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，LPS通過(guò)磷酸化和活化 Akt、p38MAPK及Erk，激活iNOS，產(chǎn)生NO，調(diào)節(jié)內(nèi)毒素休 克 的 血 管 反 應(yīng) 性［9，10］。 因 此 推 測(cè) Ang－1 和Ang－2可能通過(guò)Akt、p38MAPK和Erk激活iNOS產(chǎn)生NO，從而調(diào)節(jié)失血性休克血管反應(yīng)性的雙相變化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iNOS抑制劑可明顯恢復(fù)缺氧4h的血管低反應(yīng)性，以及顯著抑制Ang－2，進(jìn)一步降低缺氧4h血管反應(yīng)性的作用，提示iNOS參與了Ang－1和Ang－2對(duì)失血性休克晚期血管低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)；失血性休克后SMA中的iNOS蛋白表達(dá)逐漸增高，Ang－1、Tie－2、p38MAPK 和 Erk抑制劑可顯著降低缺氧4h的VEC和VSMC混合細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)和NO含量增高，提示失血性休克晚期，Ang－1和Ang－2通過(guò)p38MAPK和Erk調(diào)節(jié)iNOS的蛋白表達(dá)和NO大量產(chǎn)生，以調(diào)節(jié)血管低反應(yīng)性。

大量文獻(xiàn)表明，NO對(duì)機(jī)體的作用非常復(fù)雜，有報(bào)道其介導(dǎo)了PI3K－Akt－內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）途徑對(duì)小腸缺血的保護(hù)作用［11］，但也有報(bào)道其介導(dǎo)了LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，iNOS和NO在失血性休克晚期起到了降低血管收縮功能的損傷性作用。對(duì)于NO具有復(fù)雜作用的原因，有研究認(rèn)為，NO如同一把“雙刃劍”，其作用究竟是保護(hù)還是損傷主要取決于誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的酶和NO產(chǎn)生的量，iNOS、eNOS和神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO量之比為105∶16∶96；就心臟而言，0.1～10μmol的NO即可增強(qiáng)收縮，加快心率，而＞100μmol的NO則表現(xiàn)為負(fù)性收縮和負(fù)性頻率的作用［12］。因此本實(shí)驗(yàn)中NO對(duì)血管反應(yīng)性的損傷可能由于iNOS誘導(dǎo)NO大量產(chǎn)生所引起。但NO導(dǎo)致休克血管反應(yīng)性損傷的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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