粉防己堿對急性胰腺炎大鼠血清灌注的離體大鼠胃的保護作用及其機制*

曹明華， 李永渝， 徐 菁， 馮雅靜， 林旭紅， 李 琨

(同濟大學醫學院病理生理教研室，消化系疾病研究所，上海 200092)

1000-4718(2012)09-1665-05

2012-04-24

2012-07-30

國家自然科學基金資助項目(No. 30971168； No. 81141050)

△通訊作者 Tel: 021-65981021; E-mail: liyongyu@tongji.edu.cn

粉防己堿對急性胰腺炎大鼠血清灌注的離體大鼠胃的保護作用及其機制*

曹明華， 李永渝△， 徐 菁， 馮雅靜， 林旭紅， 李 琨

(同濟大學醫學院病理生理教研室，消化系疾病研究所，上海 200092)

目的研究急性胰腺炎(AP)大鼠血清對帶血管灌流的離體大鼠胃內、外分泌功能的影響以及粉防己堿(Tet)的干預作用及其機制。方法采用大鼠膽胰管逆行注射3%去氧膽酸鈉復制AP模型，造模后5 h取動物血清。制備帶血管灌流的離體大鼠胃, 經胃動脈輸注AP血清, 并用Tet干預。從門靜脈收集流出液，檢測其中胃泌素、生長抑素、白細胞介素6(IL-6)及細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子1(CINC-1)水平的變化。同時從食管下段經賁門插管灌注生理鹽水，從幽門收集流出液檢測其中胃蛋白酶及胃酸分泌的變化。結果AP大鼠胰腺組織破壞嚴重，胃壁出現多處糜爛、出血和潰瘍，血清淀粉酶活性明顯升高。用此AP血清灌流可引起離體胃胃泌素分泌增多,生長抑素分泌減少，IL-6和CINC-1分泌也增加，同時胃腔流出液中胃酸和胃蛋白酶含量增加。Tet可一定程度逆轉AP血清刺激引起的胃泌素、胃酸和胃蛋白酶分泌的增多以及生長抑素分泌的抑制, 減少炎癥介質的釋放(P<0.05)，減輕胃黏膜損傷。結論急性胰腺炎相關的胃損害與炎癥血清有害成分的刺激有關。Tet可干預AP血清刺激所致的離體大鼠胃內、外分泌功能的改變，從而發揮對胃的保護作用。

急性胰腺炎； 胃； 粉防己堿

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP) 是臨床常見的急腹癥,病死率高, 重癥急性胰腺炎患者可出現多種全身并發癥，甚至出現多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，其中胃是最易受損的器官之一,主要表現為急性胃黏膜損傷及應激性潰瘍。據報道有52%的急性胰腺炎病人存在急性胃黏膜損害或應激性潰瘍，并可從抗酸治療中獲益[1-2]。所涉及的機制尚不十分清楚。 粉防己堿(tetrandrine,Tet),又名漢防己甲素,是中藥粉防己的主要成分, 是一種天然的非選擇性鈣通道阻滯劑(calcium channel blocker, CCB), 具有廣泛的藥理作用，但其對胃內、外分泌的影響報道很少。本實驗采用AP大鼠血清對離體胃進行血管灌流, 并用Tet干預,觀察它們對離體胃內、外分泌的影響以及灌流液中細胞因子及炎癥介質水平的變化,以期進一步闡釋Tet對急性胰腺炎合并胃黏膜損害的治療作用及機制，為其臨床應用提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 6～8周齡的雄性SD大鼠66只，體重200～250 g，購自中科院上海實驗動物中心。

1.2主要試劑 Tet和去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)均購自Sigma；淀粉酶及胃蛋白酶檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；胃泌素放免試劑盒購自北京北方生物技術研究所；生長抑素放免試劑盒購自第二軍醫大學神經生物學教研室。細胞因子誘導中性粒細胞化學趨化因子1 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant 1, CINC-1)及白細胞介素6 (interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒均購自上海滬宇生化試劑有限公司。

1.3主要儀器 Leica DM2500顯微鏡 (Leica)；ELx800 酶標儀(BioTek)；Delta 320 pH計(Mettler-Toledo)；AJ-5803微量注射泵(上海安潔電子設備有限公司)；光電GC-2010型10探頭微機放免儀(科大創新股份有限公司中佳分公司)。

2方法

2.1AP模型復制 雄性SD大鼠48只，術前禁食12 h,隨機分為2組(每組24只)：對照組(假手術組)、急性胰腺炎組(AP組)。參照Aho等[3]的方法復制急性胰腺炎模型。胰膽管逆行注射3%去氧膽酸鈉造成AP。假手術組僅開腹暴露胰腺并輕輕翻動。造模后5 h分別腹主動脈穿刺取血液。并取胃、胰腺組織, 固定、包埋、切片, 蘇木素-伊紅(HE) 染色。光學顯微鏡下觀察胃和胰腺組織病理改變。離心血液, 取上清備用。用淀粉酶檢測試劑盒檢測血清淀粉酶(amylase，AMS) 活性。

2.2離體大鼠血管灌流胃模型的制備 同上SD大鼠18只, 隨機分為3組(每組6只)：對照組、急性胰腺炎組(AP組)和Tet處理組。按文獻[4]介紹的方法制備帶血管灌流的離體大鼠胃。簡述之：(1)逐一結扎胃與脾之間的動脈、靜脈交通支后，移去脾臟；(2)結扎左、右腎動脈，從腹主動脈向心方向插入一連于微量注射泵的塑料管，管之頂端低于胃動脈水平位置；(3)距肝門約3 cm 的門靜脈處向心方向插一引流管，管的頂端低于胃靜脈水平位置；(4)近膈肌處結扎腹主動脈、近肝門處結扎門靜脈；(5)結扎食管，從食管下段經賁門插入一連于另一微泵的塑料管，并從幽門處向心方向插一引流管。剪去無關組織器官，將帶有血管灌流的胃移出鼠體，置于恒溫38 ℃的盛有Krebs-Ringer緩沖液的塑料盒中。經血管平衡灌流Krebs-Ringers 緩沖液30 min(1 mL/min)后開始正式實驗和取樣, 包括：(1)基礎灌流，即Krebs-Ringers 緩沖液灌注20 min,收集流出液；(2)血清灌流, 對照組用假手術組的大鼠血清灌注，AP組用急性胰腺炎大鼠血清灌注，AP+Tet組灌注液為Tet(10-4mol/L)溶解于急性胰腺炎大鼠血清中，灌注20 min,收集流出液；(3)后平衡灌流，即再次用Krebs-Ringer緩沖液灌注20 min，收集流出液。用放免法測流出液中胃泌素及生長抑素的含量，用ELISA法測定IL-6和KC的含量。灌注液及流出液中各指標的差值即為離體胃對其分泌量。同時從食管下段經賁門的插管灌注生理鹽水(pH=7, 1 mL/min),從幽門收集流出液，檢測其中胃蛋白酶及pH值的變化。灌流結束后胃組織固定、包埋、切片, 蘇木素-伊紅(HE) 染色。光學顯微鏡下觀察病理改變。每1只大鼠胃只作1次系列實驗灌流用。

3統計學處理

結 果

1急性胰腺炎造模后血清淀粉酶變化、胰腺病理改變和胃的大體觀變化

AP大鼠血清淀粉酶[(3 682.1±284.3)U/dL]較正常大鼠[(682.5±60.1)U/dL]有明顯升高(P<0. 01)，血性腹水出現,病理切片觀察到胰腺組織嚴重水腫，出血，腺泡壞死, 炎癥細胞浸潤等炎癥表現，見圖1B，說明AP大鼠模型復制成功。胃的大體觀可見胃壁多處糜爛、出血和潰瘍形成，見圖1C、D。

Figure 1. Morphological changes of pancreatic tissues and stomachs of rats with acute pancreatitis (AP). A: representative section derived from the pancreatic tissue of a sham operation rat; B: representative section from the pancreatic tissue of a rat treated with sodium deoxycholate (HE staining, scale bar=50 μm); C，D: photographs of the stomach from an AP rat with serosa side (C) and mucosa side (D).

圖1急性胰腺炎大鼠胰腺及胃的形態學改變

2Tet對AP大鼠血清刺激的離體大鼠胃內分泌功能的影響

如圖2所示，灌流40 min時，在AP大鼠血清刺激下，離體大鼠胃門靜脈流出液中胃泌素水平比對照組升高(P<0.05),而生長抑素水平減少(P<0.05)。Tet可一定程度逆轉AP血清刺激引起的胃泌素增加及生長抑素分泌的變化(P<0.05)，且與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。

3Tet對AP大鼠血清刺激的離體大鼠胃外分泌功能的影響

與對照組比較，在灌流40 min時，AP組胃腔流出液中胃蛋白酶及胃酸分泌水平均升高(P<0.05)。Tet可明顯降低AP大鼠血清刺激的離體鼠胃胃蛋白酶和胃酸分泌水平(P<0.05)，且與對照組比較無顯著差異(P>0.05),見圖3。

4Tet對AP大鼠血清刺激的離體大鼠胃炎癥介質的影響

結果顯示，與對照組比較，灌流40 min時，在AP大鼠血清刺激下，AP組門靜脈流出液中IL-6及KC水平均升高(P<0.05)。Tet可明顯降低AP大鼠血清刺激的離體大鼠胃血管灌流液中IL-6及KC的水平 (P<0.05)，且與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

圖2Tet對AP大鼠血清刺激的離體大鼠胃內分泌功能的影響

圖3Tet對AP大鼠血清刺激的離體大鼠胃外分泌功能的影響

圖4Tet對AP大鼠血清刺激的離體大鼠胃炎癥介質的影響

5Tet對AP血清刺激的離體大鼠胃組織形態學的影響

灌流結束后，取離體大鼠胃組織病理切片進行HE染色，觀察到用AP大鼠血清灌流后，出現輕微的胃黏膜破壞，用Tet干預后的鼠胃未見明顯黏膜破壞，見圖5。

Figure 5. Effect of Tet on the morphological changes of isolated rat stomachs (HE staining). Scale bar=100 μm. A: control; B: AP; C: AP+Tet.

圖5Tet對AP血清刺激的離體大鼠胃組織形態學的影響

討 論

急性胰腺炎常并發鄰近及遠隔器官的損害，除肺以外,胃、腸是其中最易受損的器官。有研究表明急性胰腺炎時胃黏膜損害與應激情況下交感神經興奮、糖皮質激素分泌增多及有效血容量減少有關，而急性胰腺炎時血液成分及內環境的改變可能參與急性胰腺炎相關急性胃黏膜損害的發生，但罕見相關報道。本研究中我們用急性胰腺炎大鼠的血清灌流離體胃組織，排除了整體情況下交感神經、糖皮質激素及血容量減少等因素的影響，而聚焦于AP血液成分改變對胃內、外分泌的影響。急性胰腺炎時血清中含有大量對機體有害的毒性物質, 包括: (1) 大量的有活性的酶類, 如胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、彈性蛋白酶、磷脂酶A2(phospholipase, PLA2)等；(2)內毒素； (3)血管活性物質,如緩激肽、補體等；(4) 促炎癥介質及細胞因子: 如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8； (5) 其它毒性物質, 包括: 氧自由基作用于組織細胞后的毒性產物丙二醛, 對細胞有直接毒性作用的游離脂肪酸等[5-8]。這樣的血清和腹水對機體多個組織器官有著不同程度的影響。有學者報道，AP血清和腹水可導致肺毛細血管床破壞、肺泡間隔增厚及炎性細胞浸潤, 可能在AP并發急性肺損傷的發生機制中起重要作用[9]。另有學者發現, AP血清和腹水對肝臟、腎臟、胃腸及循環系統也有一定的損傷作用[10-13]，AP血清中的有害成分是進一步損傷組織細胞、促進AP發展的重要因素，其對組織細胞的損傷作用機制涉及到細胞內鈣超載、核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB) 的激活、PLA2的活化以及炎癥反應的放大[14]。細胞內鈣超載可導致細胞線粒體功能障礙, 可激活多種鈣依賴的降解酶, 可促進氧自由基的生成等, 從而引發細胞損傷[15]。張紅等[16-17]的研究報道, 胰腺腺泡細胞鈣超載參與脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) 誘導的 NF-κB的活化及鈣依賴性PLA2的活性增強, 而PLA2可能會通過分解細胞膜磷脂, 導致細胞膜溶解和破壞, 引起細胞損傷。 本研究發現，用AP大鼠血清灌流離體大鼠胃, 其內、外分泌功能出現紊亂，胃泌素分泌增多而生長抑素分泌減少，同時胃酸和胃蛋白酶分泌增多，且炎癥介質如IL-6和KC釋放增加。已知胃泌素刺激胃酸及胃蛋白酶分泌，而生長抑素可對抗胃泌素的作用。可見AP血清刺激造成胃黏膜的攻擊因子作用增強，而保護因子作用減弱，由此，可能引起胃腔內H+濃度增高，激活胃蛋白酶原并反向彌散進入胃壁,從而破壞胃壁組織細胞的結構和功能，對胃黏膜產生損害作用。

Tet是中藥粉防己的主要有效成分。Tet既是天然非選擇鈣通道阻滯劑, 又是鈣調蛋白的拮抗劑, 具有廣泛的藥理作用。早期藥理研究表明, Tet具有消炎、鎮痛、降壓、抗矽肺等作用。臨床用于治療高血壓、矽肺等疾病已取得了較好療效。有研究發現Tet還是一個廣譜抗炎藥物, 它可通過鈣拮抗作用降低炎癥白細胞PLA2的活性，抑制多種炎癥介質如IL-1、TNF的產生,減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[18]。我們先前的研究發現，用AP大鼠血清和腹水刺激大鼠離體胰腺腺泡細胞, 看到胰腺腺泡細胞存活率下降及細胞內鈣超載,Tet可通過降低[Ca2+]i發揮對AP大鼠血清和腹水刺激的胰腺腺泡細胞的保護作用[7]。

在本研究中用Tet干預可逆轉AP血清刺激引起的胃內、外分泌的失衡，降低炎癥介質釋放水平，尤其明顯的是降低胃泌素、胃蛋白酶和胃酸分泌，減少IL-6和CINC-1釋放水平，從而發揮對胃的保護作用。上述實驗結果表明, AP血清刺激引起的胃內、外分泌失衡及炎癥反應放大在AP合并的急性胃黏膜損傷發病機制中可能起有重要作用；Tet可通過多個環節干預AP相關的胃黏膜損傷,其臨床治療應用值得進一步探究。

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Protectiveroleoftetrandrineinisolatedratstomachsperfusedbyserumfromratswithacutepancreatitis

CAO Ming-hua, LI Yong-yu, XU Jing, FENG Ya-jing, LIN Xu-hong, LI Kun

(DepartmentofPathophysiology,InstituteofDigestiveDiseases,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China.E-mail:liyongyu@tongji.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of the serum from rats with acute pancreatitis (AP) and tetrandrine on endocrinal and exocrinal functions of isolated rat stomachs.METHODSAcute pancreatitis was induced in Sprague-Dawley rats by the method of retrograde bilio pancreatic duct injection with 3% sodium deoxycholate. The rat serum was collected 5 h after induction of AP, and used as an irritant to perfuse rat stomach. Endocrinal functions of the isolated rat stomachs were investigated by detecting gastrin and somatostatin in venous effluent, and exocrinal functions of the isolated rat stomachs were investigated by measuring pepsin and acid output in gastric lumen effluent. The releases of the cytokines and chemokines in venous effluent of the isolated rat stomachs were also examined.RESULTSAfter induction of AP in the rats, the pancreatic tissue was damaged seriously, and obvious mucosal erosion and hemorrhages were also demonstrated in the stomach. The serum amylase level increased as well. The perfusion with AP rat serum caused significant increase in the levels of gastrin and inflammatory mediators, and decrease in the level of somatostatin in the venous effluent, and increase in the levels of pepsin and H+in the gastric lumen effluent. Tetrandrine reversed the serum-induced changes, including the changes of the gastric morphology in certain degree.CONCLUSIONToxic substances in AP serum induce injury to the endocrinal and exocrinal functions of the isolated rat stomachs. The gastroprotective and anti-inflammatory effects of tetrandrine indicates therapeutic potential for acute gastrointestinal mucosal lesions in acute pancreatitis.

Acute pancreatitis; Stomach; Tetrandrine

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.022