鎂對哮喘患者外周血CD4 + CD25 + 調節性T 細胞凋亡及Foxp3 表達的影響*

梁瑞韻， 伍 衛， 黃 瑾， 江山平， 黃林潔， 李依群

(1中山大學孫逸仙紀念醫院呼吸內科，廣東 廣州510120;中山大學附屬第五醫院2心內科，3呼吸內科，廣東 珠海519000)

支氣管哮喘(哮喘)是一種免疫失衡性疾病，既往觀點認為Th1/Th2 失衡在哮喘的發病機制中扮演著重要角色。但近年來研究發現CD4+T 細胞的其中一個亞群具有調節功能并參與哮喘的免疫調節，其中，CD4+CD25+T 細胞的作用受到很大的關注。尤其是CD4+CD25+調節性T 細胞(regulatory T cells，Treg)紊亂導致的免疫耐受破壞在哮喘的發病機制中起著重要作用。CD4+CD25+T 細胞在哮喘發病中的作用引起了人們的廣泛關注，其作為一群調節機體免疫應答的重要細胞，本身也應存在一個被調節的過程，在人體微環境改變的情況下，CD4+CD25+T 細胞能否被調控呢?

眾所周知，鎂能緩解氣道平滑肌痙攣，使支氣管擴張。由于其有效、使用安全、副作用少，鎂劑在哮喘的應用已得到廣泛推廣。而鎂能否調節CD4+CD25+T 細胞的凋亡情況及其特殊的轉錄因子叉頭框蛋白3(forkhead box protein 3，Foxp3)的表達，目前未見相關報道。本實驗擬通過分離純化并培養健康人及哮喘患者外周血中CD4+CD25+T 細胞，以鎂劑干預后，再檢測CD4+CD25+T 細胞的凋亡情況及其Foxp3的表達情況，了解鎂對哮喘患者CD4+CD25+T 細胞的影響，以更深入地了解支氣管哮喘的發病機制，從而為支氣管哮喘的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 研究對象

健康成年人16 人，平均年齡(25 ±13)歲，男6 名，女10名，為本院健康志愿者。哮喘患者16 人，平均年齡(33 ±12)歲，男10 名，女6 名，符合《支氣管哮喘防治指南》診斷標準，為本院門診及住院病人，均未使用鎂劑或影響鎂排泄的藥物(如利尿劑)2 周以上，未使用糖皮質激素類藥物或停用1 周以上;其中8 例為支氣管哮喘急性發作患者。

2 主要試劑和儀器

完全培養基包括RPMI－1640(Gibco)、10% 小牛血清(杭州四季清公司)、2 mmol/L L－谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素;淋巴細胞分離液(1 073 g/L，上海恒信化學試劑有限公司);注射用硫酸鎂(2.5 g∶10 mL，廣州化學試劑廠，批號070402);碘化丙啶(propidium iodide，PI;Sigma);核糖核酸酶A(RNaIse A，25 mg;Sigma);鼠抗人IgG1－FITC/IgG1－PE (Becton Dickinson);CD25－FITC/CD4－PE (Becton Dickinson);鼠抗人CD8純化抗體(Becton Dickinson);Phycoerythrin－Cy5(PE－Cy5);抗人Foxp3 抗體(eBioscience);羊抗鼠IgG 免疫磁珠(goat anti－mouse IgG immunomagnetic beads，晶美生物工程有限公司);FACSCalibur 型流式細胞儀(Becton Dickinson);HERAcell CO2培養箱(Heraeus)。

3 方法

3.1 健康人及哮喘患者外周血CD4+CD25+T 細胞的分離及培養 按說明書進行，具體如下:(1)所有受試者無菌取外周靜脈血15 mL，分離、洗滌外周血單核細胞，并分離出T 淋巴細胞。(2)按2 μg∶107cells 加入鼠抗人CD8 純化抗體，反應后離心棄上清中未結合的抗體，按60 μg∶107cells 加入羊抗鼠IgG 免疫磁珠，反應后加入RPMI－1640 完全培養基重懸細胞，磁分離器分離，收集未被免疫磁珠結合的細胞懸液(即CD4+T 細胞)至另一干凈管中。(3)按2 μg∶107cells 加入鼠抗人CD25 純化抗體，反應、離心后棄上清中未結合的抗體，按60 μg∶107cells 加入羊抗鼠IgG 免疫磁珠，反應后加入RPMI－1640 完全培養基重懸細胞，磁分離器分離，收集被免疫磁珠結合的細胞懸液(即CD4+CD25+T 淋巴細胞)至另一干凈管中。(4)用24 孔板培養，分空白組和鎂劑干預組(鎂離子終濃度為10 mmol/L)，以RPMI－1640 完全培養基調整細胞終濃度，使每孔5 ×105cells∶1.5 mL，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養72 h，收集0 和72 h 細胞進行相關檢測。

3.2 外周血CD4+CD25+T 細胞純度的檢測 (1)取100 μL CD4+CD25+T 細胞懸液，洗滌后在各測定管中加入CD25－FITC/CD4－PE 各20 μL，向陰性對照管中加入小鼠IgG1－FITC/IgG1－PE 單抗各20 μL，避光孵育并離心2 次。(2)于流式細胞儀(CellQuest 程序)中檢測10 000 個細胞，于FSC－SSC點圖設矩形門R1 排除碎屑，再作IgG1－FITC/IgG1－PE 點圖，設陰性對照十字門使包括左下象限95%細胞，將陰性對照圖中的十字門復制、粘貼于CD25－FITC/CD4－PE 點圖中，統計分析CD4+CD25+T 細胞陽性率。

3.3 CD4+CD25+T 細胞占CD4+T 細胞的比例檢測 (1)取100 μL CD4+T 細胞懸液(1 ×105細胞)加入抗CD4－PE/CD25－FITC 單抗各20 μL，避光孵育。(2)向陰性對照管中加入小鼠IgG1－FITC/IgG1－PE 單抗各20 μL，避光孵育。(3)調整細胞濃度，于流式細胞儀(CellQuest 程序)中檢測，統計分析CD4+CD25+T 細胞陽性率。

3.4 DNA 含量分布的流式細胞儀檢測 (1)收集細胞并離心，70%乙醇500 μL 4 ℃固定24 h 以上，以PBS 洗滌后離心2 次，加入5 g/L RNase A 10 μL，室溫避光反應后加入10 mg/L PI 染液10 μL，4 ℃避光染色。(2)調整細胞濃度，以488 nm 激發波長，于流式細胞儀(CellQuest 程序)中檢測細胞，于FSC－SSC 點圖設矩形門R1 排除碎屑，再作FL2W－FL2A 點圖及FL2A－counts 直方圖，統計亞二倍體峰比例變化。

3.5 Foxp3 在CD4+CD25+T 細胞表達強度的流式細胞術檢測 (1)分離外周血CD4+CD25+T 細胞后，調整細胞濃度為1 ×109/L，取100 μL 細胞懸液(1 ×105細胞)加入新配制的固定/透膜液1 mL，4 ℃避光反應60 min，洗滌2 次，離心后棄上清。(2)加入PE－Cy5 標記抗人Foxp3 抗體20 μL，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后離心棄上清。(3)調整細胞濃度，用流式細胞儀檢測，于FSC－SSC 點圖設矩形門R1 排除碎屑，做Foxp3 直方圖并記錄其均值，CellQuest 軟件獲取并分析數據。

4 統計學處理

采用SPSS 13.0 軟件進行獨立樣本t 檢驗。數據以均數±標準差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 外周血CD4 +CD25 +T 細胞的純度檢測

健康人外周血CD4+CD25+T 細胞的純度為77.4% ～92.3%，哮喘患者CD4+CD25+T 細胞的純度為75.2% ～93.8%，見圖1。

Figure 1. Purity of CD4 +CD25 +T cells detected by flow cytometry. A，B:heath group;C，D:asthma group.圖1 外周血CD4 +CD25 +T 細胞純度的流式細胞儀檢測

2 CD4 +CD25 +T 細胞占外周血CD4 +T 細胞的比例

在健康人中的比例為4.12% ～7.98%，在哮喘患者中的比例為4.51% ～8.68%，流式細胞術檢測見圖2，兩者相比，差異沒有統計學意義(P ＞0.05)。

Figure 2. Ratio of CD4 +CD25 +T of CD4 +T cells detected by flow cytometry.A，B:health group;C，D:asthma group.圖2 外周血CD4 +CD25 +T 占CD4 +T 細胞比例的流式細胞術檢測

3 鎂(10 mmol/L)對健康人及哮喘患者外周血CD4 +CD25 +T 細胞Foxp3 表達的影響

經鎂(10 mmol/L)干預后，哮喘組CD4+CD25+T 細胞培養72 h，Foxp3 表達強度與健康對照組相比，P ＞0.05，提示鎂(10 mmol/L)對哮喘組外周血CD4+CD25+T 細胞的Foxp3 表達無影響，見圖3。

Figure 3. Foxp3 expression in CD4 +CD25 + T cells after magnesium treatment detected by flow cytometry.A:evacuation of the debris;B:Foxp3 expression in asthma group;C:Foxp3 expression in health group.圖3 鎂處理后外周血CD4 +CD25 + T 細胞Foxp3 表達的流式細胞術檢測

4 鎂(10 mmol/L)對外周血CD4 +CD25 +T 細胞凋亡的影響

經鎂(10 mmol/L)干預后，CD4+CD25+T 細胞培養72 h，流式細胞術檢測凋亡率見圖4，健康組與哮喘組分別與陰性對照組相比，P ＜0.05，提示鎂(10 mmol/L)可以誘導健康人及哮喘患者外周血CD4+CD25+T 細胞凋亡率增加，見表1，而鎂(10 mmol/L)干預組的72 h 外周血CD4+CD25+T 細胞的凋亡率在哮喘組與健康組中沒有顯著差異(P ＞0.05)。

Figure 4. Apoptosis of CD4 +CD25 + T cells after magnesium treatment detected by flow cytometry.A，B:evacuation of the debris;C:asthma group;D:health group.圖4 鎂處理后外周血CD4 +CD25 + T 淋巴細胞凋亡的流式細胞術檢測

表1 鎂對外周血CD4 +CD25 +T 細胞凋亡率的影響Table 1. Effects of magnesium (10 mmol/L)on apoptotic rate of CD4 +CD25 +T cells (%. ±s.n=12)

表1 鎂對外周血CD4 +CD25 +T 細胞凋亡率的影響Table 1. Effects of magnesium (10 mmol/L)on apoptotic rate of CD4 +CD25 +T cells (%. ±s.n=12)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs blank.

Group Asthma Health Magnesium 11.68 ±4.91＊＊ 10.76 ±3.77*Blank 8.07 ±4.90 8.83 ±4.25

討 論

鎂離子(magnesium ion，Mg2+)抑制鈣內流，減少細胞內鈣離子濃度，拮抗鈣離子對支氣管平滑肌的作用，從而使支氣管擴張;鎂離子使運動神經末梢乙酰膽堿的釋放量減少，對抗乙酰膽堿對平滑肌細胞的興奮作用，直接舒張平滑肌，改善氣道狹窄，從而改善肺的通氣和換氣功能;臨床實驗證明硫酸鎂還可降低氣道高反應性，抑制非特異性炎癥反應，預防及改善哮喘患者的氣道重塑，提高其氣流受限的可逆化程度，從而預防和緩解哮喘癥狀［1－2］。在本課題組的前期研究中，亦證實應用鎂劑可明顯改善哮喘患者的肺功能［3］，細胞內鎂缺乏的C57BL/6 哮喘小鼠肺組織β2受體表達減少，在激動劑作用下更易發生β2受體低調節［4］。

目前對支氣管哮喘免疫調節方面的研究已成為熱點，近年來認為CD4+T 細胞除了Th1、Th2 等外還包括多種調節性T 細胞亞群，均在哮喘患者的免疫調節中起重要作用。Treg是指能夠控制或抑制其它細胞功能的T 細胞群體，其中CD4+CD25+Treg 最受關注，是通過胸腺產生的功能成熟的T細胞亞群，約占外周血中CD4+T 細胞的5% ～10%［5］，是Treg 的主要組成部分。目前多個研究表明，CD4+CD25+Treg的數量或功能異常有可能導致多種自身免疫性疾病的發生［6－7］，因此對CD4+CD25+Treg 的研究有重要意義。然而對CD4+CD25+Treg 還缺乏足夠的認識，其作用機制及免疫生物學特性尚有許多不明之處，如能在體內外有效誘導、擴增和控制CD4+CD25+Treg 數量或調節其細胞功能，將會為支氣管哮喘的治療提供新思路。

本實驗中，CD4+CD25+T 細胞占外周血CD4+T 細胞的比例在健康人和哮喘患者中的比例無統計學差異，可能與本文選用的哮喘患者部分為非急性發作患者有關，但經鎂劑處理后，健康組和哮喘組的CD4+CD25+Treg 凋亡均增加，哮喘組的凋亡率高于健康組，但由于哮喘急性發作者數量少(只有8 例)，故差異不顯著，但仍然提示適當補充鎂劑對于CD4+CD25+Treg 的凋亡有正調節作用，可能對于哮喘急性發作患者作用尤為明顯。

近年研究認為轉錄因子Foxp3 是CD4+CD25+Treg 的一個相對特異性標記，與其的發育和功能有關［8］，Foxp3 作為一特殊的轉錄因子特異地高表達于CD4+CD25+T 細胞，有研究認為其數量可以反映CD4+CD25+T 細胞的水平和功能活性［9］。但也有研究認為Foxp3 對于CD4+CD25+Treg 的產生或活化是必需的，但不足以影響其功能，可能還存在其它因素的調節［10］。

本實驗中，硫酸鎂可以誘導健康人及哮喘患者外周血CD4+CD25+T 細胞72 h 的凋亡率增加，但不影響Foxp3 的表達，表明硫酸鎂調節凋亡的作用與機體的疾病狀態(哮喘)不相關，具有廣泛調節作用，有可能應用于其它免疫相關疾病，而且與Foxp3 的表達不相關。本文進行了離體細胞鎂劑共培養的實驗，但未進行鎂劑治療哮喘的人體試驗以及動物實驗，有待下一步的研究以證實鎂劑治療哮喘的作用機制之一為調節CD4+CD25+T 細胞的凋亡。

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