QF-PCR技術在快速產前診斷常見非整倍體染色體異常中的應用*

滕奔琦， 章 鈞， 林 穎， 王青青， 林俊偉， 葉燕綢， 侯紅瑛

(中山大學附屬第三醫院婦產科，廣東 廣州 510630)

1000-4718(2012)09-1644-07

2012-07-04

2012-08-27

廣東省科技計劃項目(No.2011B061200045)；廣州市科技計劃項目(No.2010GN-E00221)；廣東省科技計劃項目(No.2009B060700107)

△通訊作者Tel： 020-85252625; E-mail: tenben@tom.com

QF-PCR技術在快速產前診斷常見非整倍體染色體異常中的應用*

滕奔琦， 章 鈞， 林 穎， 王青青， 林俊偉， 葉燕綢， 侯紅瑛△

(中山大學附屬第三醫院婦產科，廣東 廣州 510630)

目的利用定量熒光PCR(QF-PCR)產前診斷常見非整倍體染色體異常。方法對95例羊水樣本采用QF-PCR技術檢測短串聯重復序列(STR)的多態性信息含量(PIC)，并將所得實驗結果與染色體核型分析結果進行比較。結果QF-PCR檢測發現95例羊水標本中正常63例，21三體14例(1例嵌合型，1例易位型)，18三體4例，(45,X)3例，(47,XXX)8例；檢測結果與染色體核型分析結果一致。QF-PCR檢測結果的符合率為96.8%。結論QF-PCR可快速檢測非整倍體染色體異常，并且結果可靠。

非整倍體； 短串聯重復序列； 多態性信息含量

材 料 和 方 法

1標本來源

標本來源于2011年1月至2012年8月于我院符合產前診斷指征并行羊膜腔穿刺抽取羊水標本95例。羊膜腔穿刺抽取羊水方法：孕婦取仰臥位，確定穿刺位點，常規消毒鋪巾，在B超探頭引導下行羊膜腔穿刺，抽取羊水20 mL，其中18 mL用于羊水細胞培養染色體分析，2 mL用于QF-PCR檢測。所有孕婦行羊膜腔穿刺前均已簽署知情同意書。

2主要試劑和儀器

2.1主要試劑TaqDNA聚合酶和熒光素(FAM、HEX和TAMRA)購自Invotrigen；Qiagen DNA Mini Kit、PCR 反應緩沖液、dNTP和Mg2+購自Qiagen。

2.2主要設備 遺傳分析儀(3100)、PCR擴增儀(9600)為ABI產品；染色體核型分析系統為上海北昂醫療技術有限公司產品；微量移液器為Finnpipette產品；高速離心機為上海安亭科學儀器廠產品。

3方法

3.1引物設計和合成 根據文獻及Genomic Data Base，使用Primer 3.0設計PCR 引物。選取5條目標染色體上雜合率高、片段長度不一的STR位點共12個及1個性別標記位點AMXY。通過預實驗，最終將13對引物分為2組，性染色體和21號染色體上的7對引物(D21S1435、D21S1411、D21S11；AMXY、DXS981、DX6809、X22)為1組，13和18號染色體6對引物(D13S631、D13S742、D13S634；DXS981D、18S535、D18S978、D18S977)為1組。性染色體和13號染色體引物的正義引物上加上熒光素FAM標記；21和18號染色體引物的正義引物上加上熒光素HEX標記。AMXY為性別標記位點，AMX：女性；AMX、AMY：男性；見表1。

高職院校學校層面建立的創客空間，要有效孵化來自理工文商等不同學科背景的大學生創新創業項目，培養大學生創新創業綜合能力，客觀上來講值得進一步研究。高職院校大學生創新創業，在創業上關注過多，創新上關注較少。因此，本文從二級學院(系部)創辦創客空間的角度出發，研究高職院校大學生創新創業人才培養路徑。

表1 12對STR位點及AMXY位點的引物序列

3.2PCR反應體系 10×PCR buffer (含Mg2+)2.5 μL；dNTP (2.5 mmol/L)2.0 μL；Primer Mix(10 μmol/L)根據多重PCR調整的引物劑量和濃度加入正向引物和反向引物。模板DNA 1.0 μL；Taq酶(5×106U/L)0.125 μL；加水(去離子滅菌水)至總體系25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min,93 ℃30 s,60 ℃30 s,72 ℃ 30 s,40個循環,72 ℃7 min,4 ℃保存。

3.3多重熒光PCR產物檢測 取去離子甲酰胺 9 μL與GS500 0.5 μL混合，再加入PCR產物 1 μL 放置PCR儀中98 ℃變性5 min，立即置于冰上5 min，轉移至上機板上。將樣本放入ABI 3100遺傳分析儀的樣品架中，設置相關參數，輸入樣品信息，POP4凝膠電泳30 min。最后通過GeneMaker 1.80軟件系統進行定量分析。

3.4QF-PCR 非整倍體診斷的判斷標準 根據國際公認的判斷標準(ACC/CMGS best practice meeting was held on the 15th April, 2004)，正常雙峰面積比值(高峰面積∶矮峰面積)區間為：0.8～1.4，凡雙峰面積比值>1.8或者<0.65，則可判定為三體，1個樣本出現2個有意義位點方可明確診斷[1-2]。

4統計學處理

結 果

1正常核型羊水細胞QF-PCR檢測結果

QF-PCR所選12個STR位點在66例核型正常胎兒中的PIC分別為：DXS981(0.815)、DX6809(0.741)、X22(0.658)；D21S1435(0.667)、D21S1411(0.870)、D21S11(0.833)；D18S535(0.759)、D18S978(0.759)、D18S977(0.704)；D13S631(0.667)、D13S742(0.926)、D13S634(0.778)。在所選的12個STR位點中，9個STR位點PIC均較高，3個位點(X22、D21S1435和D13S631)的PIC稍低，見表2。

2非整倍染色體異常疾病的QF-PCR檢測結果

QF-PCR檢測95例羊水樣本結果正常63例，Down綜合征14例，Edwards綜合征4例， Turner綜合征3例，Klinefelter綜合征8例。QF-PCR 診斷結果與染色體核型分析結果一致。異常結果STR位點擴增分析結果見表3、表4。結果判定:染色體上的任意STR位點出現3個等位基因熒光峰，峰值面積比值為1∶1∶1時，或者STR位點出現2個等位基因熒光峰,峰值面積比為2∶1或1∶2 或出現峰值面積未達到2∶1或1∶2，但<0.65 或者>1.8 時，診斷為非整倍體染色體異常。AMX 與AMY 面積比值接近1∶1，提示該胎兒為男性。其中1例Down綜合征男性胎兒陽性樣本的基因掃描圖像見圖1，經染色體核型分析結果為: 47，XY，+21，核型圖見圖2；1例Down綜合征陰性樣本的檢測結果見圖3，經染色體核型分析結果為: 46，XY，核型圖見圖4。

表2正常標本12個STR位點的檢測結果

STRlocusHeterozygosityRatiooftwopeakareaamongheterozygotes95%CIDX9810．8151．175±0．1101．126～1．114DX68090．7401．160±0．8511．120～1．201X220．6851．165±0．1501．105～1．224D21S14350．6671．186±0．0771．160～1．212D21S14110．8701．088±0．1051．057～1．119D21S110．8331．136±0．1031．105～1．168D13S6310．6670．971±0．1110．932～1．009D13S7420．9261．094±0．0881．069～1．119D13S6340．7781．080±0．0651．061～1．101D18S5350．7591．143±0．1311．099～1．187D18S9780．7591．102±0．0831．075～1．129D18S9770．7041．113±0．0831．082～1．143

表3常染色體異常標本(21三體14例或18三體4例)6個STR位點檢測結果

Table 3. The results of 6 STR loci in chromosome aneuploidies(14 cases of trisomy 21 and 4 cases of trisomy 18)

STRlocusThreepeaksTwopeaksSinglepeakRatioofpeakareaD21S14356802．083±0．162D21S14116621．970±0．136D21S116802．013±0．108D18S535202—D18S9782201．934±0．000D18S9770403．331±0．521

表4性染色體異常標本(47，XXX8例和45，X3例)4個STR位點檢測結果

Table 4. The results of 4 STR loci in chromosome aneuploidies(sex chromosome)

STRlocus47，XXX45，XRatioofpeakareaThreepeaksTwopeaksSinglepeakSinglepeakAMXY08031．951±0．245S98104431．565±0．466S680904431．133±0．057X2204432．510±0．014

圖1示1例Down綜合征男性胎兒羊水標本的基因掃描圖像,D21S1435呈現峰面積比例2∶1，D21S1411呈現峰面積比例2∶1，D21S11呈現三峰面積比例1∶1∶1。這3個位標均強烈提示胎兒為21三體綜合征患者。AMX與AMY面積之比值接近1∶1，提示該胎兒為男性。經過染色體核型分析證實胎兒是21三體綜合征男性患者，其核型分析結果是：47,XY,+21。

Figure 1. Typing of the DNA genescan of one of trisomy 21 syndrome fetus.The D21S11 (green, 309～364 bp) marker showed triallelic trisomic peaks. The D21S1435 (green, 170～194 bp) and D21S1411 (green, 241～271 bp) markers showed diallelic trisomic peaks. The X and Y chromosome-specific AMXY markers were amplified (blue, 101～109 bp).

圖11例Down綜合征陽性樣本DNA基因掃描分型圖

Figure 2. Chromosomal karyotype of one of trisomy 21 syndrome fetus.

圖21例Down綜合征陽性樣本染色體核型圖

圖3示胎兒的AMX為單峰, 提示為女性胎兒。DX981、DX6809及X22均呈現2個面積比接近于2∶1的雙峰，提示胎兒存在3條X染色體。據此預測胎兒同時存在3條X染色體, 核型為47, XXX。其它染色體上的各位標熒光峰均顯示正常，經染色體核型分析證實，符合Jacobs綜合征的診斷，見圖4。

圖5示胎兒的AMX為單峰，提示為女性胎兒。DX981、DX6809及X22均呈現單峰，提示僅1個X染色體的存在。據此預測胎兒核型為45，X。其它染色體上的各位標熒光峰均顯示正常，經染色體核型分析證實，符合45，X單體綜合征的診斷。

3QF-PCR技術的檢測結果與染色體核型分析結果的比較

95例羊水標本均成功進行QF-PCR檢測，發現正常63例，21三體14例，18三體4例，X單體3例，三體(47，XXY)8例。上述檢測結果與染色體核型分析結果一致。但2例核型為46,XX的X染色體上的3個STR位點及1例核型為46,XX的18號染色體上的3個STR位點出現純合子的情況，QF-PCR方法對其診斷出現信息量不足的情況，導致結果無法判斷。95例羊水標本行染色體核型分析均成功，發現66例為正常核型，14例為21三體，其中包括嵌合型1例，核型為46，XY，der(21：21)(46.7%)/46,XY(53.3%)，易位型1例，核型為46，XY，-14，+t(14q21q)，18-三體4例，(45,X)3例，(47,XXY)8例。QF-PCR檢測結果的符合率96.8%；對于21、18、13、X 及Y 染色體非整倍體的檢出率為100%，假陽性率為0，假陰性率0，見表5。

Figure 3. Typing of the DNA genescan of one of Jacobs syndrome (47,XXX) fetus.The AMX showed monosomic peak (blue, 102 bp). The DX981 (blue, 144～174 bp), the DX6809 (blue, 200～230 bp) and the X22 (blue, 250～294 bp) markers showed diallelic trisomic peaks.

圖31例Jacobs綜合征(47,XXX)陽性樣本DNA基因掃描分型圖

Figure 4. Chromosomal karyotype of one of Jacobs syndrome (47,XXX) fetus.

圖41例Jacobs綜合征(47,XXX)陽性樣本染色體核型圖

Figure 5. Typing of the DNA genescan of one of Turner syndrome (45，X) fetus.The AMX (blue, 102.3 bp), the DX981 (blue, 160.6 bp), the DX6809 (blue, 209.3 bp) and the X22 (blue, 302.9 bp) markers showed monosomic peak.

圖51例Turner綜合征(45，X)陽性樣本DNA基因掃描分型圖

Figure 6. Chromosomal karyotype of one of Turner syndrome (45，X) fetus.

圖61例Turner綜合征(45，X)陽性樣本染色體核型圖

表5 QF-PCR技術的檢測結果與染色體核型分析結果

4妊娠結局隨訪

14例21三體及4例18三體胎兒在QF-PCR檢測發現異常后，均于抽取羊水后1周內住院引產， 引產后取胎兒皮膚組織再次行QF-PCR檢測及染色體核型分析，均與產前診斷結果相符。66例羊水染色體核型正常的孕婦均妊娠至34周后分娩，新生兒未見明顯異常。

討 論

QF-PCR是一種通過對STR進行擴增，以對染色體拷貝數目異常進行快速產前診斷的方法。QF-PCR 應用了光譜技術與計算機技術相結合，其優點主要表現在高敏感性、高特異性、高精確性、高效性等方面。STR遺傳多態性可用雜合度和多態信息量等指標來衡量, 多態信息量大于0.5, 表明遺傳標記可提供高度的遺傳信息[3]。多態位點的基因頻率、雜合度、多態信息含量等參數因樣本來源、群體不同而有差異。本實驗所選用的9個STR位點DXS981、DX6809、D21S1411、D21S11、D18S535、 D18S978、D18S977、D13S634和D13S742的PIC均較高，3個位點(X22、D21S1435和D13S631)的PIC稍低，但均在0.5以上, 表明本實驗所選取的STR位點基本上可提供高度的遺傳信息。

在實際操作中1個正常的二倍體細胞的2個等位基因中的一個會被優先擴增, 并隨著反應的進行被優先擴增的產物也被用作模板過度表達[4]，所以在本實驗結果中顯示的等位基因峰面積比值并不完全是1∶1，比值范圍在0.97～1.18 之間，與文獻報道的正常雜合二倍體每一檢測位點雙峰面積比值一般在0.8～1.4的范圍相符合[5]。

本研究使用D21S1435、D21S1411、D21S11等新位點對14例21三體、4例18三體、3例X單體和8例X三體(47，XXX)進行檢測。通過3～4個位點的結合檢測, 檢出率高達100%。文獻報道使用4個以上位點結合檢測21三體才可達100%。因此，上述位點可被用于常見非整倍體染色體異常的快速產前診斷。

本研究中95份羊水標本經QF-PCR技術擴增成功，所有結果均在48 h內得出，其中所有染色體核型分析正常的樣本用QF-PCR檢測均無染色體數目異常，21、18、13、X 及Y五種染色體非整倍體用QF-PCR 技術均可全部檢出，無假陽性。本研究結果表明QF- PCR 技術在檢測這五種非整倍體上敏感性和特異性均為100%，與核型分析比較快速、成本低、所需樣本量少、自動化程度高、操作簡便及適合大規模應用，所以QF-PCR可作為核型分析培養失敗的一個補充。

本研究發現2例性染色體3個STR位點為純合子及1例18號染色體上3個STR位點均為純合子的標本，QF-PCR技術對其診斷出現信息量不足的情況，這主要是因為染色體上的特異性STR位點數選用少的原因，可以通過增加STR檢測位點來解決。本實驗中1例嵌合型21三體，嵌合比例46.7%，被準確檢測出。QF-PCR技術對于嵌合體的檢測存在一定的局限性。應用QF-PCR方法目前僅能檢出包括常見非整倍體異常, 尚不能檢出染色體平衡易位及異常核型<15%三體細胞或<20%單體細胞存在時嵌合體[6]。QF-PCR 檢測結果還會受到檢測位點選擇、STR 位點雜合度等因素的影響, 因此在臨床項目開展中要考慮到QF-PCR方法的上述局限性。在患者來源上主要選擇對單純唐氏高風險和高齡人群的產前診斷上[7-8]。而存在超聲異常的胎兒患染色體病的可能性較無超聲異常者明顯增加，可能存在分子學方法檢測不到的染色體異常[9-10]。

隨著QF-PCR技術的不斷完善和研發，快速產前診斷的不斷發展, 臨床實踐中將會有更多有價值的遺傳標記被發掘出來。

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QuantitativefluorescencePCRforrapidprenataldiagnosisofcommonchromosomeaneuploidies

TENG Ben-qi, ZHANG Jun, LIN Ying, WANG Qing-qing, LIN Jun-wei, YE Yan-chou, HOU Hong-ying

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:tenben@tom.com)

AIM: To evaluate the effectiveness of quantitative fluorescence PCR (QF-PCR) as a method for rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidyies.METHODSPolymorphism information contents (PIC) of each short tandem repeat (STR) in 95 cases of amniotic fluid samples were detected by QF-PCR and the data were compared with the results of routine chromosome karyotype analysis.RESULTSThe results of QF-PCR included 63 normal samples and 14 trisomy 21, 4 trisomy 18, 3 (45, X) and 8 (47, XXX). The rapid QF-PCR assay was successful to detect all aneuploidies involving chromosomes 21, 18, 13, X and Y in prenatal diagnosis, which were verified by chromosome karyotype analysis. The results showed that the total coincidence rate between QF-PCR and routine chromosome karyotype analysis was 96.8%.CONCLUSIONThe QF-PCR is a reliable method of detecting common chromosome aneuploidies for rapid prenatal diagnosis.

Aneuploidy; Short tandem repeat; Polymorphism information content

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.019