靶向沉默ADAM10 基因對心肌細胞N－cadherin 加工的影響*

李小鷗， 黃 巍， 陳亞雋， 周麗榮

(1武漢大學人民醫院兒科，湖北 武漢430070;2武漢市醫學科學研究所，湖北 武漢430032 3華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院呼吸與危重癥醫學科，湖北 武漢430030)

神經型鈣黏蛋白(neural cadherin，N－cadherin)是調節細胞與細胞之間、細胞與基質之間黏附反應的重要媒介，對維持組織結構形態起重要作用。N－cadherin 與連環蛋白(catenins)形成N－cadherin/catenins 復合體(鈣－連復合體)可使N－cadherin 集中定位細胞與細胞間的接觸部位，該復合體任何一種成分異常都會影響到N－cadherin 介導的細胞黏附功能。

基于對N－cadherin 加工代謝過程的深入了解，現已在成纖維細胞和神經細胞中發現N－cadherin 有一條非常重要的解整合素金屬蛋白酶家族ADAMs(a disintegrin and metalloproteinase proteins)加工途徑，ADAMs 在N－cadherin 胞外域N 端的R714－I715處將其水解，破壞了N－cadherin 的分子完整性，影響了鈣－連復合體的形成，導致其功能喪失并引發相應的病理生理改變［1－2］。研究表明在成纖維細胞和神經細胞中，N－cadherin 的ADAMs 加工途徑對相應系統功能的正常發揮起關鍵作用［2］，參與上述加工途徑的蛋白水解酶主要是ADAM 家族中的ADAM9、ADAM10 和ADAM17，特別是ADAM10 發揮了尤為重要的作用［3］。但是心肌細胞中ADAMs 和N－cadherins 相互作用的研究僅是開始，很多問題尚不清楚，本研究將靶向沉默ADAM10 的siRNA 表達載體導入大鼠心肌細胞，并建立穩定表達的細胞系，通過觀察該載體對細胞N－cadherin 的ADAMs 加工途徑的影響，以明確心肌細胞中ADAM10 在N－cadherin 底物加工過程中的重要性，目的是為探求該加工途徑在維持心肌組織結構形態和完整性中的作用打下基礎。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

大鼠ADAM10 干擾載體［sc－270165 ADAM10 siRNA(r)］購自Santa Cruz，兔抗ADAM10 抗體購自eBioscience，兔抗N－cadherin 抗體購自Abcam，AP 標記羊抗兔抗體購自Santa Cruz。嘌呤霉素購自Sigma。轉染試劑脂質體LipofectamineTM2000 為Invitrogen 產品。

2 方法

2.1 細胞復蘇與培養 大鼠心肌細胞(H9c2)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。液氮中取出H9C2 細胞，37 ℃水浴化凍，快速放入含10%胎牛血清、0.5% 青鏈霉素的MEM 培養液中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育，生長至90% 密度時傳代，轉染前1 d 換無抗生素的培養液過夜。

2.2 建立穩定表達的H9c2 細胞株 轉染前1 d 取對數生長期的H9c2 細胞以2 ×105cells/well 的密度接種于24 孔板。無抗生素MEM 培養液(10%FBS)培養過夜。待細胞貼壁生長達80%～90%融合時，棄去細胞培養液，用無血清培養液洗滌細胞1 次，然后按脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000 的說明書將提取并純化的sc－270165 ADAM10 siRNA(r)質粒轉染H9c2 細胞，轉染后4 h 更換培養液，用含5 mg/L 嘌呤霉素的培養液培養，48 h 觀察瞬時表達情況，3 ～4 d 后當對照組細胞大部分死亡時，根據嘌呤霉素最小致死濃度實驗，改用3 mg/L 的嘌呤霉素維持篩選，每2 ～3 d 換液傳代，2 周后抗性克隆初步形成。在細胞融合達80%時，將細胞移至6 孔板培養，篩選單克隆至培養瓶中擴增，并在細胞的對數生長期收集細胞，進行各項實驗。

2.3 Western blotting 檢測ADAM10 蛋白的表達 RIPA 法提取轉染組和空白對照組細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。50 μg 總蛋白進行10% SDS－PAGE 電泳，300 mA 2h 轉至NC膜。NC 膜經5%脫脂奶粉的TBS－T 溶液室溫封閉2h 后，與兔抗鼠ADAM10 抗體(1∶600)4 ℃孵育過夜。TBS－T 溶液洗膜3 次后，NC 膜與HRP 標記羊抗兔II 抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBS－T 溶液再次漂洗3 次后ECL 化學發光觀察。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析。實驗重復3 次。

2.4 Western blotting 檢測N－cadherin 及其C 末端片段(Cterminal fragment，CTF) I 抗為兔抗N－cadherin 的多克隆抗體，抗原識別表位針對N－cadherin 的C 端，也識別CTF，其余方法同2.3。

2.5 流式細胞技術檢測心肌細胞跨膜表達的N－cadherin

用PBS 將上述離心后的細胞吹打下來，再用PBS 洗2 次后，加入以PBA(含10%BSA)1∶100 稀釋的抗N－cadherin 抗體，4 ℃作用1 h，PBS 洗2 次，加入1∶60 稀釋的熒光II 抗，4 ℃作用1 h，PBS 洗2 次，細胞懸浮0.5 mL PBS，進行流式細胞術檢測N－cadherin。

2.6 心肌細胞黏附實驗 每孔100 μL 纖維連接蛋白(10 mg/L)包被96 孔板，以100 mg/L 多聚賴氨酸和1%牛血清白蛋白包被孔作為最大和最小黏附參照。將空白對照組和穩轉細胞組細胞分別制備成5 ×108cells/L 細胞懸液，每孔加入100 μL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵育3 h。磷酸鹽緩沖液洗滌除去未黏附細胞，多聚甲醛固定，1% 亞甲藍溶液染色20 min，每孔加入100 μL 1 mol/L HCl，37 ℃40 min，酶標儀測定600 nm 處吸光度(A)，細胞黏附率(%)= (實驗組A 值－牛血清白蛋白孔A 值)/(多聚賴氨酸孔A 值－牛血清白蛋白孔A 值)×100%。

3 統計學處理

結 果

1 穩轉細胞株的建立

脂質體法轉染H9c2 細胞，經嘌呤霉素篩選后建立穩定表達細胞株。Western blotting 檢測ADAM10 蛋白的表達，見圖1。結果顯示與對照組相比，轉染ADAM10 siRNA 細胞的ADAM10 蛋白水平降低了75.2%。表明本實驗所用的siRNA能有效而特異地沉默ADAM10 基因，抑制其蛋白表達。

Figure 1. Expression of ADAM10 protein detected by Western blotting.圖1 轉染組與對照組ADAM10 蛋白的表達

2 Western blotting 檢測細胞N－cadherin 及其CTF 蛋白表達

Western blotting 檢測ADAM10 siRNA 轉染組和對照組N－cadherin 及其CTF 蛋白表達。轉染組細胞中N－cadherin蛋白的表達較正常細胞明顯增多，CTF 蛋白表達明顯減少，見圖2。

3 流式細胞術檢測心肌細胞表面N－cadherin 表達的變化

陰性對照組N－cadherin 的表達為(42.23 ±2.52)%，轉染組心肌細胞表面N－cadherin 的表達為(73.48 ±3.41)%，與對照組相比明顯增多(P ＜0.05)。

Figure 2. The expression of N－cadherin and its C－terminal fragment (CTF)detected by Westem blotting. * P ＜0.05 vs control.圖2 N－cadherin 及其CTF 的蛋白表達

4 細胞黏附實驗

陰性對照組細胞黏附率為(40.21 ±4.50)%，ADAM10 siRNA 轉染組為(60.23 ±6.50)%，差異有統計學意義(P ＜0.05)，表明轉染組心肌細胞黏附率較對照組明顯升高。

討 論

眾所周知，閏盤是心肌細胞的連接結構，使心肌形成一個功能上的整體。鈣－連復合體作為心肌細胞閏盤中間連接的一個重要組成成分，是形成閏盤結構的關鍵分子基礎，已成為近年來的研究熱點。鈣－連復合體位于閏盤的黏合膜，同時也是肌原纖維的附著點，在心肌細胞的發育及成熟階段高度表達［4］。它同細胞骨架的相互聯系和相互作用有重要功能［4］:(1)介導心肌細胞間的黏附反應，使心肌細胞形成牢固連接;(2)固定心肌纖維的定向排列，防止心肌纖維滑脫，保持心肌纖維舒縮的一致性和協調性。因此，鈣－連復合是心肌細胞形態維持、物質運輸和跨膜信息傳遞的重要結構基礎。

鈣－連復合體功能的正常發揮有賴于其完整性，其組成成員質和量的改變都可以引起復合體的功能異常。目前在成纖維細胞和神經細胞中發現ADAM10 可以特異性水解N－cadherin，產生N 端的NTF(95 kD)和C 端的CTF1(40 kD)，再由γ－分泌酶將CTF1 片段進行水解，產生可溶性的CTF2(35 kD)。跨膜的N－cadherin 依次被ADAMs 和γ－分泌酶水解，分子的完整性遭到破壞，影響了鈣－連復合體的形成［4－5］。鑒于以上成纖維細胞和神經細胞中的研究結果，我們推測心肌細胞中N－cadherin 也存在這樣ADAMs 加工途徑，對N－cadherin 在細胞中的定位分布及鈣－連復合體的形成有重要作用

為了證明我們的推論，本實驗首先利用ADAM10 siRNA轉染入大鼠心肌細胞(H9c2)，通過嘌呤霉素篩選，成功獲得了ADAM10 穩定沉默的心肌細胞株。Western blotting 檢測結果顯示ADAM10 siRNA 穩轉細胞組與陰性對照組相比，N－cadherin 蛋白表達水平明顯提高，同時CTF 的表達也有所下調，流式細胞術的結果也提示轉染組心肌細胞跨膜表達的N－cadherin 增加。以上結果說明心肌細胞中ADAM10 對N－cadherin 的加工水解對N－cadherin 在細胞中的定位分布及鈣－連復合體的形成有重要作用。黏附實驗的結果表明轉染組心肌細胞黏附能力明顯提高，從而進一步明確了心肌細胞中ADAM10 對N－cadherin 的水解破壞了N－cadherin 分子的完整性，影響了鈣－連復合體的形成，并引發了相應的病理生理改變。

［1］ Matsuda T，Fujio Y，Nariai T，et al. N－cadherin signals through Rac1 determine the localization of connexin 43 in cardiac myocytes［J］.J Mol Cell Cardiol，2006，40(40):495－502.

［2］ Reiss K，Maretzky T，Ludwig A，et al. ADAM10 cleavage of N－cadherin and regulation of cell－cell adhesion and β－catenin nuclear signaling［J］.EMBO J，2006，25(4):762－765.

［3］ Zhou J，Qu J，Yi XP，et al. Upregulation of γ－catenin compensates for the loss of β－catenin in adult cardiomyocytes［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(1):H270－H276.

［4］ Kostetskii I，Li J，Xiong Y，et al. Induced deletion of the N－cadherin gene in the heart leads to dissolution of the intercalated disc structure［J］. Circ Res，2005，96(3):346－354.

［5］ Marabaoud P，Wen Ph，Dutt A，et al. A CBP binding transcriptional repressor produced by the PS1/epsilon－cleavage of N－cadherin and regulation of cell－cell adhesion and β－catenin nuclear signaling［J］. EMBO J，2005，24(4):742－752.