HPLC法測定復方氨基酸注射液(18AA-Ⅳ)中5-羥甲基糠醛的含量*

張 莉，黃哲甦

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

復方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)臨床上主要用于改善外科手術前后病人的營養狀態，適用于各種疾病引起的營養不良，同時作為節氮療法補充營養。復方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)質量標準現收載于國家藥品標準新藥轉正標準第44冊。5－羥甲基糠醛(5－hydroxymethylfurfural)為該制劑中的原料組分葡萄糖在放置及加熱滅菌過程中的分解產物。由于5－羥甲基糠醛損害人體橫紋肌和內臟，因此在含有葡萄糖成分的輸液類制劑中應嚴格控制5－羥甲基糠醛的含量［1］。原國家標準采用顏色反應(不產生櫻桃紅色)來控制樣品中的5－羥甲基糠醛量，該法為定性反應，準確性差。為進一步準確測定復方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)中5－羥甲基糠醛的含量，確保人民用藥安全。本文建立了高效液相色譜法測定復方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)中5－羥甲基糠醛的含量，方法簡便、準確、重復性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC－20A島津液相色譜儀，梅特勒XS205電子天平。

1.2 試藥 5－羥甲基糠醛對照品(CHEMICAL LTD，批號L460k10，純度:98%);復方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)(天津天安藥業股份有限公司，批號201003141、 201003154、 201007311、 201008193、201009261、201101154、201103281 和 201103293);甲醇(色譜純)、磷酸二氫鉀和四丁基氫氧化銨溶液(分析純)、蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex PRODIGY ODS(3)C18100A 分析柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:磷酸鹽緩沖液［0.1 mol/L的磷酸二氫鉀溶液和四丁基氫氧化銨溶液(取0.01 mol/L四丁基氫氧化銨溶液用磷酸調節pH值至4.5)等量混合］－甲醇(95∶5);流速:1.0 m l/min;檢測波長284 nm;柱溫:40℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取5－羥甲基糠醛對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 ml中含15μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品直接作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方量制備不含有葡萄糖的樣品作為陰性對照溶液。

2.3 方法專屬性考查 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液依法測定記錄色譜圖，見圖1。結果，陰性對照溶液在對照品相同保留時間處無吸收峰，表明樣品中無干擾5－羥甲基糠醛的成分存在。

圖1 對照品(A)供試品(B)陰性對照(C)HPLC色譜圖

2.4 線性關系考查 精密量取150μg/m l的5－羥甲基糠醛對照品儲備液，用水配制成濃度0.029 89、0.119 6、0.597 8、1.793 4、2.989、5.978、8.967、11.956、14.945、17.934、20.923 和 23.912 μg/ml的系列對照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液20μl，照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標，相對應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸。結果表明5－羥甲基糠醛在0.029 9～23.912μg/ml濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系。回歸方程為Y=79 420.25 X+441.18(r=0.999 6)。

2.5 檢出限試驗 取5－羥甲基糠醛對照品，用水稀釋制成不同濃度的溶液，在選定色譜條件下，按信噪比為3對最低檢測量進行測定。結果表明，5－羥甲基糠醛最低檢出濃度 0.03 μg/m l，檢出限為 0.3 ng。

2.6 溶液的穩定性 取供試品溶液分別在0、2、4、6和8 h進樣，考查溶液室溫放置穩定性，結果表明，供試品溶液在8 h內穩定。

2.7 回收率試驗 取5－羥甲基糠醛對照品，配制3個濃度(300、375和450μg/ml)的樣品溶液，每個濃度取3份，分別精密量取1ml，置25ml量瓶，加空白輔料溶液稀釋至刻度。照“2.1”項下色譜條件進行分析，結果平均回收率為99.10%，RSD為1.08%。

表1 5-羥甲基糠醛回收率試驗結果(n=9)

2.8 中間精密度試驗 取本品(批號201103281)，由不同人員，不同日期，在不同儀器上測定含量，RSD為1.60%。

2.9 樣品中5－羥甲基糠醛含量測定 取8批復方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)樣品，按本法測定5－羥甲基糠醛的含量，結果見表2。

表2 樣品中5-羥甲基糠醛含量測定結果

3 討論

3.1 對于含有葡萄糖成分的輸液制劑，其中所含5－羥甲基糠醛的檢查方法中，干擾較少、準確度較高的為HPLC法，《中國藥典》2005年版二部首次收載了采用該法檢查葛根素葡萄糖注射液中5－羥甲基糠醛的含量。由于5－羥甲基糠醛是作為雜質檢查，因此檢測波長的選擇較為重要，否則將影響其檢出，甚至漏檢。5－羥甲基糠醛的最大吸收波長為284 nm，因此HPLC法檢查時該波長應為首選檢測波長。

3.2 流動相的選擇，參考了《中國藥典》2010年版二部收載的含有葡萄糖成分的輸液制劑中有關物質5－羥甲基糠醛測定的色譜條件。經反復試驗，最終選定胞磷膽堿鈉葡萄糖注射液［2］有關物質項下的色譜條件適宜測定復方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)中5－羥甲基糠醛的含量，分離效果較好。

3.3 目前已批準的含有葡萄糖成分的輸液制劑大多對5－羥甲基糠醛限度進行控制，但限度范圍不一。一般約為0.02%(以葡萄糖計)。根據《中國藥典》2005年版二部葡萄糖注射液中5－羥甲基糠醛檢查的規定，供試品葡萄糖溶液的濃度為10 mg/ml，“在284 nm的波長處測定，吸光度不得大于0.32”。初步推測《中國藥典》所規定的“吸光度不得大于0.32”時相對應的5－羥甲基糠醛濃度約為2μg/ml，即5－羥甲基糠醛的限度為0.02%(以葡萄糖計)。本方法根據此限度確定了對照品溶液的濃度。

3.4 該制劑8批樣品中含5－羥甲基糠醛很少，但是在生產和儲藏過程中葡萄糖容易降解生成5－羥甲基糠醛。因此有必要對該制劑的5－羥甲基糠醛含量進行控制，以確保用藥安全。

1 何伍，凌霄.含葡萄糖注射液中5－羥甲基糠醛限度的檢測方法.中國醫藥工業雜志，2008，39(1):47

2 中國藥典.二部.2010:603