甲狀旁腺激素相關蛋白對人間充質干細胞成脂肪分化的影響*

楊玉嘉，張 凱，白 雪，王 毅

(天津市天津醫院，天津 300211)

PTHrP最初是從引起高鈣血癥的惡性腫瘤組織中分離出來，其與甲狀旁腺激素在編碼基因、分子結構和受體功能上有許多相同或相似之處［1］。但PTHrP促進骨合成代謝的分子機制尚未十分清楚，還須作進一步研究。本實驗分析了PTHrP(1－86)作用于人間充質干細胞(hMSCs)后其脂肪特異性基因脂蛋白脂肪酶(LPL)的表達，以進一步闡述其對基質細胞分化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 骨髓來源 5份骨髓標本均來源于本院創傷性股骨頭置換手術患者，其中男3例，女2例，年齡37～45歲，已確診供者無骨代謝疾病，無急、慢性感染且均經本人同意。

1.1.2 主要試劑和儀器 PTHrP(PeproTech公司，美國)，DMEM/F12培養液(Gibco BRL公司)，淋巴細胞分離液、胰島素、地塞米松、β－甘油磷酸鈉(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)，MTT(Sigma公司)，α萘酚磷酸鹽(Koch－Light Laboratories Ltd)，1%蘇丹紅染色液(蘇丹紅IV 1 g溶入體積分數為0.7乙醇溶液中過濾備用)，逆轉錄和RT－PCR試劑盒(TaKaRa，寶生物工程有限公司)，酶聯免疫測定儀(MRXⅡ，美國Dynex)，定量PCR儀(ABI 7300，美國)。

1.2 方法

1.2.1 hMSCs的分離培養及分組 分別無菌抽取各患者骨髓5～10 ml，采用淋巴細胞分離液分離法，取單個核細胞層，DMEM/F12培養基洗滌2次，沉淀物用含10%FBS－DMEM/F12培養液混懸，移至細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO2、95%飽和濕度的培養箱內培養。當hBMSCs生長融合達80%左右，用0.25%胰酶消化傳代細胞，取第3代細胞用于實驗。將每個樣本的實驗細胞分為三組:對照組，采用10%FBS－DMEM/F12培養;成脂誘導組，采用成脂誘導液(含1×10－8mol/L地塞米松、10mg/L胰島素的10%FBS－DMEM/F12［2］)培養;成脂 +PTHrP 組，采用成脂誘導液 +40 nMPTHrP培養。每48 h換液1次。

1.2.2 對細胞生長增殖的影響 分別取各組的第3代細胞按5×104/ml濃度接種于96孔細胞培養板中，每48 h換液1次，采用MTT法分別檢測各組第2、4、6、8 d時的細胞增殖情況。

1.2.3 成脂蘇丹紅 IV染色 第3代細胞按1×105/ml濃度接種于6孔細胞培養板中的蓋玻片上，每48 h換液1次，于第10、14、21日時分別對各組進行蘇丹紅IV染色。

1.2.4 對 LPL表達的影響 第3代細胞按1×105/ml濃度接種于6孔細胞培養板中的蓋玻片上，每48 h換液1 次，分別于第3、5、10、21 日時以 TRIZOL 試劑提取細胞總RNA并測定濃度，逆轉錄成cDNA，使用SYBR Green PCR試劑盒于熒光定量檢測儀進行相關基因的PCR擴增:95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 31 s，共40個循環。用每個樣本的Ct值采用2－ΔΔt方法計算mRNA的相對表達量。各基因的引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.5 統計學處理 采用SPSS 13.0統計學軟件處理數據，計量資料以±s表示，計量資料多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗各組細胞增殖水平的比較 成脂誘導組、成脂+PTHrP組細胞增殖均顯著高于對照組(P＜0.01);成脂誘導組比成脂+PTHrP組，前期無顯著性差異，從第4日起前組顯著高于后組(P＜0.05)，見表2。

2.2 實驗各組成脂蘇丹紅IV染色 第7日時成脂誘導組的蘇丹紅IV染色開始出現少量細小紅色脂滴，14日時細小脂滴逐漸增多，第21日時則胞漿內可見大量呈顆粒狀的紅色脂滴;成脂+PTHrP組14日時才出現脂滴，但脂滴數量明顯低于同期成脂誘導組;而對照組各染色點均未出現紅色脂滴，見圖1。

2.3 實驗各組成脂LPL mRNA的表達水平 LPL mRNA表達水平各實驗組比較，成脂誘導組和成脂+PTHrP組均顯著高于對照組(P＜0.05)，成脂+PTHrP組顯著低于成脂誘導組，(P＜0.05)，見表3。

表2 實驗各組細胞增殖水平(±s，n=5)

表2 實驗各組細胞增殖水平(±s，n=5)

與對照組比較，*P＜0.01;與成脂誘導組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 第2日 第4日 第6日 第8日對照組 0.284 ±0.011 0.355 ±0.020 0.393 ±0.022 0.504 ±0.052成脂誘導組 0.395 ±0.021* 0.497 ±0.012* 0.616 ±0.035* 0.753 ±0.031*成脂 +PTHrP 組 0.373±0.016* 0.431 ±0.022＊△ 0.527±0.023＊△ 0.635±0.023＊△△

圖1 hMSCs成脂誘導實驗各組蘇丹紅IV染色

表3 實驗各組成脂LPL m RNA的表達水平(x±s，n=3)

3 討論

人類PTHrP基因組DNA定位于第12號染色體基因短臂［3］，主要包括9個外顯子和3個啟動子。PTHrP基因的前mRNA通過選擇性剪接，產生三種原始翻譯產物PTHrP(1－139)、PTHrP(1－141)和 PTHrP(1－173)，然后通過轉錄和翻譯多肽修飾等多種水平的基因調控，形成具有不同的N末端、中間區域和C末端的成熟肽以及這些形式的結合物。只有成熟肽及其結合物才具有其獨特的生物學功能。PTHrP(1－34)、PTHrP(38－94)和PTHrP(107－139)是這個肽家族的主要分泌形式。近年來一些研究表明，PTHrP在胎兒和成人骨中也具有很強的協同骨形成的作用［4，5］。與PTH不同的是，PTHrP只是純粹的合成代謝劑，只選擇性地刺激骨形成。因此PTHrP在治療骨質疏松中具有廣泛的應用前景，對其研究也日趨增多，但在骨合成代謝中的分子生物學機制尚不十分清楚［6，7］。

本實驗分析比較了PTHrP(1－86)片段在hMSCs脂肪分化過程中的影響。有研究證實，MSCs在體外可通過不同的誘導劑分別向成骨和成脂方向分化［8］。本研究中，分別采用不同的誘導液培養hMSCs。表2結果顯示，成脂誘導組和成脂+PTHrP組的細胞增殖均顯著高于對照組，成脂+PTHrP組第2日時無顯著性增殖，從第4日起增殖顯著低于成脂誘導組。說明PTHrP(1－86)在后期有抑制成脂化細胞的增殖作用。圖1和表3結果顯示，成脂+PTHrP組出現脂滴陽性細胞的時間最晚，脂滴量相對于成脂誘導組較少;脂肪細胞標志基因LPLmRNA的表達水平也顯著低于成脂誘導組，由此可見PTHrP(1－86)在MSCs的成脂肪分化的過程中起到了抑制作用。有研究證明，MSCs具有內在的成骨和成脂肪分化潛能，兩者之間的分化相互關聯［9］。通過本實驗分析，PTHrP可能是通過抑制MSCs的成脂肪分化，而刺激骨形成，為其治療骨質疏松的臨床應用奠定了實驗基礎。

1 郭剛，劉新宇，梁東春，等.重組人甲狀旁腺素相關蛋白PTHrP1－86對骨質疏松大鼠治療作用的實驗研究.中國骨質疏松雜志，2008，14(1):13

2 黃定強，楊大鑒，黎萬榮，等.骨髓間充質干細胞定向誘導條件下向脂肪細胞和成骨細胞誘導分化的關系.中國臨床康復，2006，10(1):31

3 李瑛.甲狀旁腺激素相關蛋白的新認識.基礎醫學，2003，12(4):362

4 Miao D，Li J，Xue Y，etal.Parathyroid hormone－related peptide is required for increased trabecular bone volume in parathyroid hormone－null mice.Endocrinology，2004，145(8):3554

5 Miao D，He B，Jiang Y，et al.Osteoblast－derived PTHrP is a potent endogenous bone anabolic agent that modifies the therapeutic efficacy of administered PTH 1 －34.JClin Invest，2005，115(9):2402

6 Antonio Casado － Díaz，Raquel Santiago － Mora，JoseéManuel Quesada.The N－ and C－terminal domains of parathyroid hormone－related protein affect differently the osteogenic and adipogenic potential of human mesenchymal stem cells.Experimental and Molecular Medicine，2010，42(2):87

7 徐進，榮海欽.甲狀旁腺激素相關蛋白促進骨形成.國外醫學·骨科學分冊，2005，26(4):242

8 岑洪，林茂芳，黃河，等.雌激素受體α和β在間充質干細胞體外成骨、成脂肪分化中的表達變化.廣西醫科大學學報，2005，22(6):883

9 黃定強，楊大鑒，黎萬榮，等.骨髓間充質干細胞定向誘導條件下向脂肪細胞和成骨細胞誘導分化的關系.中國臨床康復，2006，10(1):31