TGF－β1基因修飾的脾細胞對大鼠肝臟移植免疫耐受的實驗研究

閆 振，李 衛，吳 波

哈爾濱醫科大學附屬第四醫院1.普外科;2.顯微外科，黑龍江 哈爾濱 150001

肝臟移植(liver transplantation，LT)目前已成為治療終末期肝病最有效的方法，然而同種異體排斥反應仍然是器官移植的主要障礙，雖然全身應用免疫抑制劑可以延長受體生存時間，但是可導致受體出現免疫功能低下，易發感染和腫瘤傾向［1］。鄭樹森等報道證實隨著移植技術和免疫抑制劑的應用，LT患者的一年生存率有很大提高，為90%［2］，如何有效減少排斥反應或抑制排斥反應，是目前器官移植的研究熱點。轉化生長因子β1是有效地免疫調控和免疫抑制分子，它在機體免疫系統中的廣泛免疫抑制作用，對細胞免疫、體液免疫以及主要參與免疫反應的一些細胞因子都有調控作用［3］。TGF-β1在心臟移植、腎臟移植、血管移植中有廣泛報道，但在肝臟移植中報道較少，本實驗利用輸注TGF-β1修飾的供者脾細胞研究TGF-β1質粒與肝臟移植的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:供體為SD大鼠40只，受體Wistar大鼠40只，均為健康雄性，體質量為250～300 g，SPF級，均由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。實驗過程對動物處置符合動物倫理學標準。

1.1.2 主要試劑:脂質體2000試劑盒及Trizol試劑:美國Invitrogen公司;質粒pAdtrack-CMV-TGF-β1質粒和pAdEasy-1-Bj51833細胞株:華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院傳染病實驗室曾令蘭教授惠贈;DP107-02高純度質粒小量試劑盒:北京天根公司產品;RPMI 1640培養基及新生牛胎血清:奧地利PAA公司;臺盼藍染色試劑:上海碧云天產品;TUNEL檢測試劑盒:上海羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 TGF-β1 質粒的制備:質粒 pAdtrack-CMVTGF-β1質粒和pAdEasy-1-Bj51833細胞株由華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院傳染病實驗室曾令蘭教授惠贈。小量提取 DH5a細胞中的pAdtrack-CMVTGF-β1質粒，Pme I線性化后，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下目的條帶，膠回收試劑盒回收連接產物的片段，取10 μL純化后的 DNA片段轉入感受態pAdEasy-1-Bj51833細胞中。鋪Kana+抗性瓊脂平板，培養16～20 h，挑取10～20個最小的克隆，用2 mL含0.025 g/L卡那霉素LB培養液振搖過夜，小量提取質粒，0.7%瓊脂糖凝膠電泳，以pAdEasy-1作參照條帶，與其大小相近的即為正確重組子。經鑒定為pAdtrack-CMV-TGF-β1質粒后大量擴增，分化提純后備用。使用時用無菌生理鹽水溶解。

1.2.2 TGF-β1基因修飾的脾細胞的制備:SD大鼠(6～8周)均在乙醚麻醉下無菌取脾，置于盛有不完全RPMI-1640培養液的培養皿中，用200目篩網研磨和紅細胞裂解液處理后獲得單個的脾細胞，再用不完全RPMI1640培養液洗滌3次，并用完全RPMI1640培養液(含10%體積/體積胎牛血清)調整終濃度至實驗所需(5×106/mL)，臺盼藍拒染法判定細胞活力＞95%，待用。培養的胞轉染前離心，置新鮮的RPMI 1640培養液中，使用脂質體2000試劑盒按照說明書轉染脾細胞，轉染的脾細胞每3天換1次培養液，10～14 d后選擇建立穩定轉染脾細胞株。

1.2.3 實驗分組與大鼠原位肝臟移植模型的建立:供體為SD大鼠，受體為Wistar大鼠，均為健康雄性，體質量250～300 g，受體體質量略大于供體，術前12 h禁食，清潔手術。實驗動物隨機分成4組，每組10只:A組:肝移植組，術前7天受體經尾靜脈輸注生理鹽水1 mL;B組:空質粒輸注組，術前7天受體經尾靜脈輸注空質粒1 mL;C組:脾細胞輸注組，術前7天受體經尾靜脈輸注脾細胞(5×106/mL)1 mL;D組:TGF-β1組，術前7天受體經尾靜脈輸注TGF-β1基因修飾的脾細胞(5×106/mL)1 mL。肝移植模型的建立采用Kamada二袖套法，并加以改進建立穩定的大鼠原位肝移植模型［4-5］。每組5只受體作為觀察生存期之用，觀察期以受體大鼠死亡為終點;另5只受體在移植后7天處死，觀察移植肝組織病理學改變，肝臟功能和凋亡的變化。各組因術中、術后發生感染、血栓形成、膽管梗阻等并發癥死亡的大鼠不列入統計之內。

1.3 檢測指標

1.3.1 肝功能檢測:手術后第 3、5、7天，在麻醉狀態下，通過手術后大鼠的陰莖背靜脈采血0.5 mL(不抗凝)，化驗肝功能，檢測血清谷丙轉氨酶(ALT)、血清總膽紅素值(TBIL)。抽血后再輸入2 mL生理鹽水作為補液。

1.3.2 凋亡指數:TUNEL檢測步驟TUNEL染色切片脫蠟至水，蛋白酶K消化15 min 4%多聚甲醛固10 min:3%H2O2，室溫封閉 10 min:0.1%TritonX-100 冰浴 2 min，每片加 50 μL，TUNEL 混合液，37 ℃ 1 h，每片加50 μL POD，37℃ 30 min，每步間 PBS洗3次。DAB顯色，水性封片劑液體封片，拍照。結果判定:應用TUNEL法檢測，凋亡細胞胞核呈棕色，胞質一般不著色或著色淡，高倍視野下陽性細胞的百分數(%)作為凋亡指數(AI)。

1.3.3 排斥反應分析:手術后第7天，從各組隨機取5只受體鼠，予以麻醉，在麻醉情況下，取移植肝臟標本，以10%的甲醛固定，行HE染色后進行組織學觀察。根據Banff排異活動指數(RAI)評分體系分級，在光鏡下觀察急性排斥反應的程度。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件分析，實驗所得數據以均數±標準差()表示，組間差異用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 穩定轉染脾細胞基因的表達 采用綠色熒光蛋白轉染到TGF-β1基因修飾的脾細胞中，穩定轉染的脾細胞同時表達TGF-β1蛋白和綠色熒光蛋白，熒光顯微鏡下可見穩定表達的脾細胞都激發綠色熒光(見圖1)。

圖1 熒光顯微鏡下見篩選后的脾細胞都激發綠色熒光，說明轉染后的脾細胞穩定表達TGF-β1蛋白Fig 1 Fluorescence microscope，filtered spleen cells to stimulate green fluores-cence，indicating that the spleen cells after transfection and stable expression of TGF-β1 protein

2.2 肝移植后各組第3、5、7天血清 ALT及血清TBIL檢測 與肝移植組及空質粒組相比TGF-β1修飾的脾細胞組肝臟功能較好，差異有統計學意義(P＜0.05)，與脾細胞組相比，TGF-β1 修飾的脾細胞組改善肝功能較好(P ＜0.05)(見表1、表2)。

2.3 肝移植后各組凋亡指數(AI，%)TGF-β1組為39.2 ±5.11，脾細胞組 17.0 ±3.67，空質粒組為 7.60±1.51，肝移植組為 4.40 ±2.07。TGF-β1 組與肝移植組及空質粒組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)，與脾細胞組相比，差異有統計學意義(P＜0.05，見圖2)。

2.4 各組病理學觀察 肝移植組及空質粒組見排斥反應較重，示匯管區增寬，大量淋巴細胞浸潤，并可見肝臟實質的破壞;脾細胞輸注組，示肝細胞輕度淤血，中等量淋巴細胞浸潤;TGF-β1組移植排斥反應較輕，匯管區形態規則，少量淋巴細胞浸潤，屬輕度排斥反應(見圖3)。

2.5 肝移植術后各組存活時間 我們利用大鼠原位肝臟移植模型對TGF-β1修飾的脾細胞在大鼠肝臟移植免疫耐受中的作用進行研究發現TGF-β1基因修飾組(36.4 ±4.16)d，生存期較肝移植組(8.4 ±1.4)d、空質粒組(7.8±0.84)d明顯延長，差異有統計學意義(P ＜0.01);與脾細胞組(20.0 ±4.00)d 相比，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表1 各組ALT結果(U/L，)Tab 1 ALT test results in each group(U/L，)

表1 各組ALT結果(U/L，)Tab 1 ALT test results in each group(U/L，)

與肝移植組和空質粒輸注組相比，△P＜0.05;與脾細胞輸注組相比，※P＜0.05

組別 例數3 d 5 d 7 d肝移植組5319.28 ±17.35 561.16 ±60.35 917.25 ±54.39空質粒輸注組 5 325.08 ±17.34 570.33 ±60.46 924.72 ±56.16脾細胞輸注組△ 5 287.62 ±21.06 216.07 ±30.50 201.62 ±33.28 TGF-β1 輸注組△※5256.99 ±9.12 172.00 ±16.52 113.23 ±20.35

表2 各組血清TBIL結果(μmol/L，)Tab 2 TBIL test results in each group(μmol/L，)

表2 各組血清TBIL結果(μmol/L，)Tab 2 TBIL test results in each group(μmol/L，)

與肝移植組和空質粒組輸注相比，△P＜0.05;與脾細胞組輸注相比，※P＜0.05

3 d 5 d 7 d組別 例數

圖2 各組大鼠術后第7天Tunel凋亡圖中棕黃色顆粒為凋亡細胞(200×)A:肝移植組;B:空質粒輸注組;C:脾細胞輸注組;D:TGF-β1修飾的脾細胞輸注組Fig 2 Tunel for liver tissues in each group at the end of 7th day，brown granules were apoptotic cells(Microscopy 200×)A:liver transplant group;B:empty vector infusion group;C:spleen cell infusion group;D:TGF-β1-modified spleen cell infusion group

圖3 各組大鼠術后第7天HE染色(100×) A:肝移植組;B:空質粒輸注組;C:脾細胞輸注組;D:TGF-β1修飾的脾細胞輸注組Fig3 HE staining for liver tissues in each group at the end of 7th day(Microscopy 100×) A:liver transplant group;B:empty vector infusion group;C:spleen cell infusion group;D:TGF-β1-modified spleen cell infusion group

3 討論

自1963年Satzrl成功實行了第1例人體原位肝移植以來，肝臟移植已成為治療終末期肝臟疾病的重要手段。但是移植排斥反應已成為阻礙其進一步發展的突出矛盾。基因技術有可能發揮其獨特作用，TGF-β1是一種重要的調節性細胞因子，對多種免疫活性細胞的增殖、分化、生物學功能起調節作用。人和鼠TGF-β1蛋白僅差一個氨基酸的不同［6］。TGF-β1具有強大的免疫抑制作用，是一種強效的免疫抑制性細胞因子，功能比環孢素還要強烈。TGF-β1抑制APC表面主要組織相容性復合物(MHCⅠ類、Ⅱ類分子)的表達［7］，干擾APC的分化成熟，使T細胞無能;TGF-β1還可以抑制NK 細胞，LAK 細胞的增殖和分化［8-9］。TGF-β1的諸多生物學功能和研究表明，在移植免疫中，移植的長期存活和移植物的耐受都與TGF-β1的生成和分泌有關。Qin等［10］將 TGF-β1基因轉移到心肌，監測移植物的存活情況。TGF-β1可抑制多種免疫細胞如T細胞、B細胞、NK細胞和細胞毒性T細胞等。Asderakis等［11］報道通過注射供體來源的 TGFβl基因修飾脾細胞，顯著延長大鼠心臟移植的存活時間。Narumoto等［12］報道膽管細胞釋放的TGF-β1可以減輕同種異體抗原的免疫反應等。

本實驗采用將構建的 pAdtrack-CMV-TGF-β1質粒，采用脂質體轉染脾細胞，獲得穩定表達的TGF-β1基因修飾的脾細胞。TGF-β1轉染組生存時間較長，監測術后第3、5、7天肝功能可發現基因修飾組肝臟功能在第5天時開始好轉，第7天逐漸恢復，而移植組肝臟功能隨著移植排斥反應加重而逐漸升高。在移植排斥反應過程中，發病過程主要是T細胞介導的免疫應答。TGF-β1在特異性免疫耐受中的作用主要通過對IL-2誘導的T細胞增殖活化發揮有效的負調節作用，影響T細胞生長因子受體、轉鐵蛋白受體的表達，抑制Rb蛋白磷酸化，誘導T細胞凋亡［13］。通過對肝臟細胞凋亡的檢測可證實TGF-β1基因修飾的脾細胞組凋亡較其他組明顯。有實驗證明TGF-β1可導致肝細胞的凋亡，在肝移植出現急性排斥反應時，隨著排斥反應增加，其表達增高，凋亡細胞數增加［14-15］。本研究結果表明隨著TGF-β1基因的高表達，移植排斥反應減輕，凋亡細胞數增加，受體生存天數延長。

通過我們的研究，認為TGF-β1是一種有效的免疫抑制因子，通過基因修飾的方法，可以提高受體的生存時間，減輕免疫排斥反應，但其抑制免疫排斥的效果有限，具體的機制還需進一步研究，本實驗以大鼠為模型，為基因治療移植排斥反應提供了一種新方法，但能否應用于臨床及可操作性需要進一步研究。

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