Ki－67表達(dá)及幽門螺桿菌感染在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中的作用

程艷麗，林 靜，劉晉紅，顧 雁，劉秀清，王亞麗，閆 偉，李玉紅，張明奎

清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.消化內(nèi)科;2.病理科;3.心臟中心，北京 100016

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因之一，與胃癌發(fā)生關(guān)系密切。在H.pylori感染相關(guān)性胃炎、胃潰瘍及胃癌病變中，H.pylori可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)其增殖［1-2］。Ki-67的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期必不可少的組成部分，也是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志基因，存在于細(xì)胞周期中除G0期以外的所有階段。Ki-67作為一個重要的細(xì)胞增殖標(biāo)記［3］，在胃腸道間質(zhì)瘤及胃癌組織中均有高表達(dá)，Ki-67標(biāo)記指數(shù)可作為胃腸道間質(zhì)瘤的預(yù)測指標(biāo)，并與癌的生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)［4-5］。但 H.pylori及 Ki-67在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中的作用尚無定論。本文通過研究Ki-67表達(dá)及H.pylori在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中的作用，以進(jìn)一步揭示阿司匹林導(dǎo)致胃黏膜病變的相關(guān)機(jī)制，指導(dǎo)臨床安全使用阿司匹林。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)從2008年12月－2011年1月清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科及心臟中心服用阿司匹林導(dǎo)致相關(guān)性胃黏膜病變患者中選擇病例189例，均經(jīng)胃鏡檢查明確診斷，并排除賁門黏膜撕裂癥、消化道腫瘤、食管胃底靜脈曲張破裂導(dǎo)致出血病例，同時排除嚴(yán)重肝腎功能不全的患者以及1個月內(nèi)有重大手術(shù)的患者。既往史中無消化道癥狀，如:上腹部疼痛、反酸、燒心、噯氣、惡心、嘔吐、食欲減退等，共136例病例入選，年齡50～78歲，平均年齡(65.66±6.01)歲。患者服用阿司匹林劑量為75～325 mg，時間最短3 d，最長2年。

1.2 臨床分組 患者在10 d內(nèi)服用阿司匹林后有嘔血和/或黑便癥狀，大便和嘔吐物隱血檢查陽性，就診24 h內(nèi)經(jīng)胃鏡檢查確診為胃和/或十二指腸潰瘍或黏膜糜爛出血，定為出血組;患者服用阿司匹林后在7 d～6個月出現(xiàn)消化道癥狀，如:上腹部疼痛、反酸、燒心、噯氣、惡心、嘔吐、食欲減退，就診24～48 h內(nèi)經(jīng)胃鏡檢查確診為胃和/或十二指腸潰瘍，定為潰瘍組;患者服用阿司匹林后在7 d～6個月出現(xiàn)消化道癥狀，就診24～48 h內(nèi)經(jīng)胃鏡檢查確診為非萎縮性胃炎伴/或不伴糜爛，萎縮性胃炎伴/或不伴糜爛，定為胃炎組;出血組患者24例，其中男16例，女8例;潰瘍組患者46例，其中男28例，女18例;胃炎組患者66例，其中男44例，女22例。對照組為健康體檢者正常胃黏膜排除H.pylori感染，共8例，男6例，女2例，年齡19～30歲，平均年齡(25.00±4.31)歲。所有入選病例均行快速尿素酶試驗檢測、病理組織學(xué)Geimsa染色及13C尿素呼氣試驗，以上3項指標(biāo)中有2項陽性定為H.pylori感染陽性，分為H.pylori感染陽性組和陰性組，并取胃黏膜組織行Ki-67檢測。

1.3 主要試劑及實驗方法

1.3.1 主要試劑:兔抗人Ki-67免疫組化單克隆抗體及S-P試劑盒均購自福州邁新公司。胃幽門螺桿菌快速尿素酶診斷試劑盒、試劑購自福建三強(qiáng)生物化工有限公司。13C尿素呼氣試驗?zāi)蛩啬z囊試劑藥盒購自原子高科股份有限公司，13C呼氣質(zhì)譜儀:ZHP2001型，購自北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.3.2 實驗方法:(1)幽門螺桿菌檢測:行胃鏡檢查時均在胃竇部取活組織2塊，其中一塊應(yīng)用胃幽門螺桿菌快速尿素酶診斷試劑盒進(jìn)行檢測。另一塊組織行病理組織學(xué)Giemsa染色;所有患者均行13C尿素呼氣試驗，陽性判斷值:以30 min時樣品中所測13C-CO2的δ‰減去零時的呼氣樣品的δ‰值的差表示，即檢測值=δ‰(30 min)－δ‰(0 min)，陽性判斷值≥4.0 ±0.4時，可判斷受試者為陽性。(2)Ki-67免疫組織化學(xué)染色檢測步驟:胃黏膜組織經(jīng)10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，4～5 μm厚連續(xù)切片后，采用免疫組織化學(xué)染色(S-P法)檢測Ki-67的表達(dá)，步驟參考試劑盒說明書操作，用已知的陽性切片作陽性對照，以 0.01 mmol/L PBS代替一抗作陰性對照。并用HE染色行常規(guī)病理組織學(xué)診斷。

1.4 H.pylori感染的診斷標(biāo)準(zhǔn) 以上3項指標(biāo)中有2項陽性，判定為H.pylori感染。

1.5 胃黏膜組織中Ki-67表達(dá)水平的計算方法 用半定量法推算各檢測樣本Ki-67表達(dá)情況［6］，分別按以下比例記分:胃黏膜上皮組織細(xì)胞染色陽性率在0～4%記0分，5% ～24%記1分，25% ～49%記2分，50% ～74%記3分，75% ～100%記4分;染色強(qiáng)度陰性為0分，染色弱，但明顯強(qiáng)于陰性對照者為1分，染色清晰者為2分，染色強(qiáng)者為3分。Ki-67表達(dá)水平用胃黏膜上皮組織細(xì)胞陽性率與染色強(qiáng)度評分的乘積來表示。

2 結(jié)果

2.1 H.pylori感染率 在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，H.pylori感染率在出血組、潰瘍組及胃炎組相比較無明顯差異(P＞0.05，見表1)。

表1 阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變患者H.pylori感染狀況Tab 1 H.pylori infection status of patients with aspirin associated gastric mucosa injury diseas

2.2 阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變組織中Ki-67表達(dá)情況 在正常胃黏膜上皮組織Ki-67無表達(dá)或呈弱陽性表達(dá)，平均染色積分為0.125±0.354。在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，胃黏膜上皮組織有較強(qiáng)程度的表達(dá)，細(xì)胞胞質(zhì)著色，呈彌漫或灶狀分布。在出血組中，有58.33%(14/24)的胃黏膜上皮組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒(見圖1)，平均染色積分為3.916 ±1.676;在潰瘍組，有 21.74%(10/46)的胃黏膜上皮組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均染色積分為2.174 ±1.527;在胃炎組，有12.12%(8/66)的胃黏膜上皮組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒(見圖2)，平均染色積分為 1.394±0.899。出血組中胃黏膜上皮組織Ki-67的表達(dá)高于潰瘍組及胃炎組(P＜0.05);Ki-67的表達(dá)在任兩組間總體均數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 H.pylori感染狀態(tài)與阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中Ki-67表達(dá)的關(guān)系 在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，H.pylori感染陽性率為 75.00%(102/136)。H.pylori感染陽性患者有25.49%(26/102)的胃黏膜上皮組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均染色積分為2.275 ±1.511;H.pylori感染陰性患者有17.65%(6/34)的胃黏膜上皮組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均染色積分為 1.588 ±1.698。H.pylori感染陽性患者的胃黏膜上皮組織中Ki-67陽性表達(dá)率明顯高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 Ki-67在出血組胃黏膜上皮組織的表達(dá)(SP 100×);圖2 Ki-67在胃炎組胃黏膜上皮組織的表達(dá)(SP 100×)Fig 1 Expression of Ki-67 in gastric mucosa in bleeding group(SP 100×);Fig 2 Expression of Ki-67 in gastric mucosa in gastritis group(SP 100×)

3 討論

細(xì)胞增殖分裂受多種因素調(diào)節(jié)。在細(xì)胞周期中，細(xì)胞DNA復(fù)制合成、有絲分裂除必需有關(guān)酶系參與外，還有些蛋白質(zhì)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，并可被相應(yīng)抗體識別，被稱為細(xì)胞增殖相關(guān)抗原，如增殖細(xì)胞核抗原、Ki-67、核仁組成區(qū)嗜銀蛋白、statin、p53。其中，Ki-67抗原是1984年由Gerdes等［7］發(fā)現(xiàn)在增殖細(xì)胞中表達(dá)的一種核抗原，由分子量分別為395 KD和345 KD的雙鏈多肽組成，由人類基因組中約3000 bp編碼。由于Ki-67結(jié)構(gòu)獨特，缺乏與之同源的序列進(jìn)行對比研究，盡管目前掌握了結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特征方面的大量資料，但其生理功能仍不清楚。大量實驗研究證明Ki-67的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期必不可少的組成部分。也是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志基因，存在于細(xì)胞周期中除G0期以外的所有階段。它開始表達(dá)于細(xì)胞周期的G1期，在S期及G2期表達(dá)增加，至M期達(dá)高峰，在分裂晚期很快消失。由于其半衰期短，脫離細(xì)胞周期后迅速降解，因此，被認(rèn)為是能較可靠地全面反映細(xì)胞群體增殖活性的客觀指標(biāo)［8-9］，已成為目前檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)［7］。Ki-67在非腫瘤性胃黏膜中不表達(dá)或低表達(dá)，說明該組織增生活性較低。在胃腸道間質(zhì)瘤及胃癌組織中均有高表達(dá)，Ki-67標(biāo)記指數(shù)可作為胃腸道間質(zhì)瘤的預(yù)測指標(biāo)，并與癌的生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)［4-5］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，非甾體類消炎藥(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)吲哚美辛可導(dǎo)致大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞增殖減少，Ki-67表達(dá)下調(diào)［10］。既往在阿司匹林誘發(fā)導(dǎo)致胃黏膜損傷的分子機(jī)制方面，認(rèn)為阿司匹林除可直接刺激胃黏膜外，同時可通過抑制環(huán)氧化酶1(Cyclooxygenase-1，COX-1)阻斷花生四烯酸代謝成前列腺素(Prostaglandins，PG)，從而抑制前列腺素的合成而致胃黏膜損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)，在正常胃黏膜上皮組織Ki-67無表達(dá)或呈弱陽性表達(dá)，平均積分為0.125 ±0.354，在阿司匹林導(dǎo)致胃黏膜病變中，出血組有58.33%(7/12)的胃黏膜上皮組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均積分為3.916±1.676;潰瘍組有21.74%(5/23)的胃黏膜上皮組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均積分為2.174±1.527;胃炎組有12.12%(4/33)的胃黏膜上皮組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均積分為1.394±0.899。出血組中Ki-67的表達(dá)高于潰瘍組及胃炎組的胃黏膜上皮組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);說明在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，隨著胃黏膜損傷的加重，Ki-67的表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞增殖可能是阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變的發(fā)病機(jī)制之一，與黏膜損傷程度有關(guān)。

有關(guān)H.pylori對細(xì)胞增殖作用的報道不一，大多數(shù)體外試驗顯示H.pylori抑制細(xì)胞增殖［11-12］，但多數(shù)人體內(nèi)胃黏膜細(xì)胞組織學(xué)研究顯示，H.pylori可促進(jìn)細(xì)胞增殖［1-2，13-15］，H.pylori感染陽性胃炎或非潰瘍性消化不良患者的胃黏膜上皮細(xì)胞增殖比對照組顯著增高，根除 H.pylori感染后會導(dǎo)致細(xì)胞增殖的降低［8］。目前研究認(rèn)為，胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖是H.pylori感染的繼發(fā)性反應(yīng)。H.pylori感染時炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞因子和氧自由基可能刺激胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖;另一方面，由H.pylori感染直接導(dǎo)致的胃黏膜的損傷和凋亡更有可能導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞的代償性增生［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，H.pylori的感染率為75.00%，其中出血組為83.33%，潰瘍組為78.26%，胃炎組為69.70%，H.pylori感染率在出血組、潰瘍組及胃炎組相比較無明顯差異(P＞0.05)，但在出血組，H.pylori感染率仍然高于潰瘍組及胃炎組，說明H.pylori感染和阿司匹林均增加了上消化道出血的危險性，兩者在導(dǎo)致上消化道出血病變中可能起協(xié)同作用。此外，在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，H.pylori感染陽性組的胃黏膜上皮組織Ki-67染色積分為2.275±1.511，陰性組胃黏膜上皮組織Ki-67染色積分為1.588±1.698，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)。說明阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變組織中，胃黏膜上皮細(xì)胞增殖不僅與阿司匹林導(dǎo)致胃黏膜損傷有關(guān)，與H.pylori感染亦有一定關(guān)系，阿司匹林和H.pylori均參與了胃黏膜的損傷，導(dǎo)致了胃黏膜增殖。在臨床工作中，若H.pylori感染陽性患者，服用阿司匹林治療時，需根除H.pylori治療，以減少胃黏膜的損傷。

［1］El-Zimaity HM，Graham DY，Genta RM，et al.Sustained increase in gastric antral epithelial cell proliferation despite cure of Helicobacter pylori infection［J］.Am J Gastroenterol，2000，95(4):930-935.

［2］Ohkura Y，F(xiàn)urihata T，Kawamata H，et al.Evaluation of cell proliferation and apoptosis in Helicobacter pylori gastritis using an image analysis processor［J］.Gastric Cancer，2003，6(1):49-54.

［3］Yonemura Y，Ooyama S，Sugiyama K，et al.Growth fraction in gastric carcinomas determined with monoclonal antibody Ki67 ［J］.Cancer，1990，65(5):1130-1134.

［4］Pollack A，DeSilvio M，Khor LY，et al.Ki-67 staining is a strong predictor of distant metastasis and mortality for men with prostate cancer treated with radiotherapy plus androgen deprivation:Radiation Therapy Oncology Group Trial 92-02［J］.J Clin Oncol，2004，22(11):2133-2144.

［5］Sun M，Zhang XY，Zou HJ，et al.The relationship of Cyclin D1，Ki67 and Bcl-2 expression with prognosis in gastrointestinal stromal tumors［J］.Chin J Gastrointest Surg，2005，8(6):542-543.孫梅，張興義，鄒洪杰，等.Cyclin D1、Ki67和Bcl-2在胃腸道間質(zhì)瘤的表達(dá)及與其預(yù)后的關(guān)系［J］.中華胃腸外科雜志，2005，8(6):542-543.

［6］Krajewska M，，Krajewski S，Epstein JL，et al.Immunohistochemical analysis of bcl-2，bax，bcl-X，and mcl-1 expression in prostate cancers［J］.Am J Pathol，1996，148(5):1567-1576.

［7］Gerdes J，Li L，Schlueter C，et al.Immunobiochemical and molecular biologic characterization of the cell proliferation associated nuclear antigen that is defined by monoclonal antibody Ki-67 ［J］.Am J Pathol，1991，138(4):867-873.

［8］Preusser M，Heinzl H，Gelpi E，et al.Ki-67 index in intracranial ependymoma:a promising histopathological candidate biomarker［J］.Histopathology，2008，53(1):39-47.

［9］Vernillo R，Lorenzi B，Banducci T，et al.Immunohistochemical expression of p53 and Ki-67 in colorectal adenomas and prediction of malignancy and development of new polyps ［J］.Int J Biol Markers，2008，23(2):89-95.

［10］Fornai M，Colucci R，Antonioli L，et al.Effects of esomeprazole on healing of nonsteroidal anti-inflammatory drug(NSAID)-induced gastric ulcers in the presence of a continued NSAID treatment:characterization of molecular mechanisms［J］.Pharmacol Res，2011，63(1):59-67.

［11］Smoot DT，Wynn Z，Elliott TB，et al.Effects of Helicobacter pylori on proliferation of gastric epithelial cells in vitro［J］.Am J Gastroenterol，1999，94(6):1508-1511.

［12］Kurosawa A，Miwa H，Hirose M，et al.Inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis by Helicobacter pylori through increased phosphorylated p53，p21 and Bax expression in endothelial cells［J］.J Med Microbiol，2002，51(5):385-391.

［13］Ohkura Y，F(xiàn)urihata T，Kawamata H，et al.Evaluation of cell proliferation and apoptos is in Helicobacter pylori gastritis using an image analysis processor［J］.Gastric Cancer，2003，6(1):49-54.

［14］Ma F，Misumi J，ZhaoW，et al.Long-term treatment with sterigmatocystin，a fungus toxin，enhances the development of intestinal metaplasia of gastric mucosa in Helicobacter pylori-infected Mongolian gerbils［J］.Scand J Gastroenterol，2003，38(4):360-369.

［15］Petersson F，Borch K，F(xiàn)ranzen LE.Gastric epithelial proliferation and p53 and p21 expression in a general population sample:relations to age，sex，and mucosal changes associated with H.pyloriylori in fection［J］.Dig Dis Sci，2002，47(7):1558-1566.

［16］Peek RM Jr，Wirth HP，Moss SF，et al.Helicobacter pylori alters gastric epithelial cell cycle events and gastrin secretion in Mongolian gerbils［J］.Gastroenterology，2000，118(1):48-59.