膽汁內(nèi)外引流術(shù)對梗阻性黃疸大鼠肺腫瘤壞死因子α、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的影響

王小鵬，吳 亮，李 聞

中國人民解放軍總醫(yī)院消化科，北京 100853

梗阻性黃疸是臨床常見的多發(fā)的癥狀或體征，引起肝臟損害的同時常伴心肺功能不全、急性腎功能衰竭等全身重要臟器功能受損，其圍手術(shù)期感染并發(fā)癥發(fā)生率和病死率均較高。梗阻性黃疸可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)甚至多器官功能衰竭綜合征(MODS)，而肺是SIRS常見的首發(fā)臟器損害，因此，梗阻性黃疸可以引起肺損傷;肺損傷可能與梗阻性黃疸時引起的內(nèi)毒素血癥及由其引發(fā)的細(xì)胞因子分泌失調(diào)密切相關(guān)。但迄今為止，術(shù)前解除黃疸在外科手術(shù)中的作用尚有爭議，膽汁內(nèi)引流與外引流，哪種引流方法更好，目前尚無一致性意見［1-2］。本研究探討大鼠梗阻性黃疸形成及其解除對肺組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)的影響，比較膽汁內(nèi)、外引流術(shù)解除黃疸對肺部炎癥反應(yīng)的作用，為臨床上梗阻性黃疸患者的術(shù)前治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠64只(體質(zhì)量330～380 g)，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。分籠單獨飼養(yǎng)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進食與飲水，維持環(huán)境溫度在15～20℃。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與分組:將大鼠隨機分為四組:假手術(shù)組(SH)、梗阻性黃疸組(OJ)、膽汁內(nèi)引流術(shù)組(ID)及膽汁外引流術(shù)組(ED)，每組16只。SH組:大鼠開腹分離膽總管，但不結(jié)扎，14 d后行二次手術(shù)分離膽管但不引流，再飼養(yǎng)14 d后取標(biāo)本。OJ組:大鼠開腹分離膽總管并結(jié)扎、切斷，建立大鼠梗阻性黃疸模型，梗阻性黃疸14 d后取標(biāo)本。ID組:OJ模型建成14 d后再次手術(shù)，于膽管末端和十二指腸間植入內(nèi)引流管，內(nèi)引流14 d后取標(biāo)本。ED組:OJ模型建成14 d后再次手術(shù)，從膽管末端插入外引流管，經(jīng)皮下引至頸背部體外并固定，外引流14 d后取標(biāo)本。

1.2.2 標(biāo)本留取:標(biāo)本采集日，在腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉大鼠后，開胸，留取左肺葉。在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗、除去血液，無菌紗布拭干、稱重，將左肺組織剪碎后倒入玻璃勻漿管中，冰浴研磨，并用生理鹽水制成10%勻漿液;低溫離心(3000 r/min)10 min，留取肺勻漿清液標(biāo)本，密封保存在－80℃低溫冰箱中。

1.2.3 肺勻漿液TNF-α濃度測定:通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，嚴(yán)格按照說明書操作，大鼠TNF-α ELISA試劑盒購自美國R＆B公司。

1.2.4 肺勻漿液NE活性測定:通過比色法測定肺組織勻漿液 NE活性:Methoxysucciny1-alany1-proly1-valine-P-nitroanilide(MEOSAAPVNA)是NE的一種特異性的合成熒光底物。用已知濃度的大鼠純化中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Sigma公司)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的NE活性。在96孔板中每孔加入0.1 mL底液［0.2 mmol/L的MEOSAAPVNA(購于 Sigma 公司)、0.1 mmol/L HEPES、0.5 mmol/L NaCl、0.1%Brij、2%二甲基亞砜，pH 值為 7.5］，用分光光度計在405 nm測定基礎(chǔ)吸光值(OD1值)。然后加入0.08 mL肺勻漿液，蓋上鋁箔，25℃孵育2 h，在405 nm測定OD2值。用已知濃度的大鼠純化中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(購于Sigma公司)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的NE活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。肺組織勻漿液TNF-α、NE含量均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()描述，多組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般形態(tài)觀察 結(jié)扎大鼠膽管14 d后，梗阻性黃疸形成，大鼠食欲下降，全身皮毛發(fā)黃，尿黃，部分大鼠呼吸稍急促，死亡大鼠鼻腔可見淡紅色血性分泌物，麻醉解剖時凝血功能較差，肝臟外膽管膨脹，肝臟彌漫性腫大，呈黃色，質(zhì)硬，呈砂粒感。行膽汁外引流術(shù)后，可見大量膽汁通過引流管排出體外，大鼠進食及活動減少，皮膚變薄，體質(zhì)量減輕或不變，死亡率高于其他各組，死亡大鼠鼻腔可見淡紅色血性分泌物。而膽汁內(nèi)引流組大鼠食欲良好，活動正常，體質(zhì)量明顯增加，肝臟色澤恢復(fù)正常，質(zhì)柔軟，無死亡。假手術(shù)組無異常、無死亡。

2.2 肺組織勻漿液TNF-α、NE含量的變化 梗阻性黃疸時大鼠肺TNF-α、NE水平較假手術(shù)對照組明顯升高(P＜0.01或0.05)。通過膽汁內(nèi)引流術(shù)解除黃疸后，大鼠肺TNF-α濃度與梗阻性黃疸組相比下降明顯(P＜0.01)，但未降至與假手術(shù)對照組同一水平(P＜0.05);而通過膽汁外引流術(shù)解除黃疸后，大鼠肺TNF-α濃度仍較高、與梗阻性黃疸組相比無差異(P＞0.05)。行膽汁內(nèi)、外引流術(shù)后，大鼠肺NE水平均有不同程度降低，但與梗阻性黃疸組相比內(nèi)引流更明顯(P＜0.05)，外引流無差異(P ＞0.05)，且內(nèi)引流恢復(fù)至正常水平，與假手術(shù)對照組相比無差異(P＞0.05，見表1)。

表1 各組大鼠肺勻漿液TNF-α、NE含量的變化()Tab 1 TNF-α and NE levels of lung in four groups rats()

表1 各組大鼠肺勻漿液TNF-α、NE含量的變化()Tab 1 TNF-α and NE levels of lung in four groups rats()

注:與SH 相比，▲P＜0.01，#P＜0.05;與 OJ相比，□P＜0.01，◇P ＜0.05

組別 TNF-α(pg/mL) NE(μg/mL)SH 64.091 ±13.034 39.718 ±9.625 OJ 100.893 ±21.271▲ 50.396 ±17.388#ID 75.141 ±15.849□# 39.390 ±12.410◇#ED 112.129 ±36.886 44.790 ±16.681

3 討論

在我們的研究中，我們采用改良的手術(shù)方式成功建立了梗阻性黃疸及膽汁內(nèi)外引流的動物模型［3］。在建立模型的預(yù)實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn):體質(zhì)量低于300 g的大鼠梗黃難以持續(xù)2周時間，死亡率偏高，83.3%(10/12)梗阻性黃疸大鼠死于第10～11 d左右，解剖死因多為膽漏，死亡時體質(zhì)量下降(70±12.6)g，考慮與梗阻性黃疸進食減少、體質(zhì)量下降、營養(yǎng)狀況惡化引起低蛋白血癥、膽總管壁彈性下降、破漏有關(guān);體質(zhì)量＞330 g的大鼠多可成功造模梗阻性黃疸持續(xù)2周，死亡率僅為11.1%(7/63)，解剖死因有膽漏、胃腸脹氣、肺淤血等。膽汁內(nèi)引流組只要二次手術(shù)成功，術(shù)后均能存活，且進食增多、體質(zhì)量上升明顯;膽汁外引流組二次術(shù)后多在8～10 d死亡，死亡時體質(zhì)量均＜220 g，解剖死因有胃腸黏膜萎縮、腹腔感染、肺淤血等，死亡率高達(dá)51.5%(17/33)。

腸道是體內(nèi)最大的細(xì)菌和毒素庫，很多動物實驗［4-5］證實梗阻性黃疸大鼠腸道細(xì)菌可移位至肺。Sewnath等［6］指出梗阻性黃疸可通過釋放炎癥因子而導(dǎo)致肺部過度炎癥反應(yīng)，從而引起肺損傷。國外研究指出梗阻性黃疸后，細(xì)菌移位至肺，產(chǎn)生大量TNF-α，從而引起肺損傷;但關(guān)于梗阻性黃疸解除后對肺損傷的影響無相關(guān)報道。因此，本研究探討了梗阻性黃疸形成后，肺損傷的變化，闡明了膽汁內(nèi)引流術(shù)與外引流術(shù)對梗阻性黃疸大鼠肺損傷的影響，加深理解了膽汁內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于外引流術(shù)的機制，為臨床治療梗阻性黃疸患者提供了實驗依據(jù)。

TNF-α是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，內(nèi)毒素是其較強的刺激劑。Kennedy等［7］實驗發(fā)現(xiàn)，無菌鼠阻塞性黃疸發(fā)生時無內(nèi)毒素血癥，內(nèi)源性TNF-α的分泌也并不增多;而一般鼠阻塞性黃疸發(fā)生時內(nèi)毒素水平明顯升高，同時內(nèi)源性TNF-α的分泌也明顯增多。TNF-α是重要的炎癥介質(zhì)，在感染和損傷引起的炎癥和免疫反應(yīng)過程中起著重要的作用，是細(xì)菌感染的重要指標(biāo)，其水平的變化與病情變化的程度相關(guān)。Beierle等［8］提示梗阻性黃疸后各種炎癥刺激可活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，當(dāng)數(shù)量過多或者作用時間過長，可導(dǎo)致ARDS甚至MODS。TNF-α在梗阻性黃疸時引起的肝功能損傷中起重要的促進作用，也是引起心、肺、腎、胃腸等損害的重要介質(zhì)，梗阻性黃疸患者很容易進展為多器官衰竭而死亡。大量動物實驗［9-10］及臨床資料［11-12］表明，梗阻性黃疸時，盡管細(xì)胞免疫功能受抑制，在內(nèi)毒素的作用下，血清TNF-α炎性細(xì)胞因子顯著升高。這與我們的實驗結(jié)果提示梗阻性黃疸時大鼠肺TNF-α水平較假手術(shù)對照組明顯升高(P ＜0.01)是一致的。我們以前的研究［13］表明，解除膽道梗阻可以降低血漿TNF水平，并且內(nèi)引流優(yōu)于外引流。Kimmings等［14］也報道膽管炎患者TNF濃度明顯升高，引流后降低。我們的實驗結(jié)果提示通過膽汁內(nèi)引流術(shù)解除黃疸后，大鼠肺TNF-α濃度與梗阻性黃疸組相比下降明顯(P＜0.01)，而通過膽汁外引流術(shù)解除黃疸后，大鼠肺TNF-α濃度仍較高，甚至超過梗阻性黃疸組平均水平，但與梗阻性黃疸組相比無差異(P＞0.05)。我們的研究從另一個方面梗阻性黃疸對肺TNF-α的影響，進一步驗證了膽汁內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于外引流術(shù)。

很多研究表明中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶在肺損傷的發(fā)病機制中起重要作用［15-16］。梗阻性黃疸形成明顯的內(nèi)毒素血癥，刺激肺臟釋放大量前炎癥因子，如TNF-α、IL-6等，募集大量中性粒細(xì)胞入肺，釋放彈性蛋白酶，分解彈性蛋白(氣血屏障細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分)，破壞上皮細(xì)胞緊密連接，增加血管通透性，造成大量血漿蛋白及活性物質(zhì)滲透至肺間質(zhì)，造成非心源性肺水腫，從而引起肺損傷。我們的研究首次探討了梗阻性黃疸時及內(nèi)外引流術(shù)對肺NE的影響，實驗顯示梗阻性黃疸時大鼠肺NE水平較假手術(shù)對照組明顯升高(P＜0.05)，膽汁內(nèi)、外引流術(shù)均可不同程度降低梗阻性黃疸時大鼠肺NE的水平，但與假手術(shù)對照組相比內(nèi)引流可降至正常水平(P＞0.05);膽汁外引流術(shù)雖然也可以降低大鼠肺NE水平，但作用小于內(nèi)引流術(shù)。

我們推測兩種引流方法影響的差異與腸肝循環(huán)有關(guān)。膽汁內(nèi)引流術(shù)能夠恢復(fù)腸肝循環(huán)，使膽汁排泄正常。膽汁有助于提高腸黏膜T2淋巴細(xì)胞數(shù)量，抑制腸內(nèi)細(xì)菌的過度繁殖和內(nèi)毒素的產(chǎn)生，維持腸黏膜屏障的完整，并能與內(nèi)毒素結(jié)合和/或?qū)⑵浞纸鉃閬唵挝欢鴾缁睿瑥亩鴾p少了梗阻性黃疸時細(xì)菌移位的發(fā)生，減輕內(nèi)毒素血癥，同時恢復(fù)紊亂的炎性細(xì)胞因子分泌，降低肺組織的炎癥反應(yīng);另外，膽汁有消化食物、吸收營養(yǎng)作用，使大鼠營養(yǎng)狀況良好，體質(zhì)量增加。相反，膽汁外引流時，雖然緩解了梗阻性黃疸，但不能建立膽鹽正常的肝腸循環(huán)，大量膽汁通過外引流管丟失，導(dǎo)致脂肪吸收不良和一些免疫物質(zhì)的丟失及水電解質(zhì)紊亂［17-18］。我們從膽汁內(nèi)外引流術(shù)對梗阻性黃疸大鼠肺腫瘤壞死因子α、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶影響的實驗觀察中，進一步支持膽汁內(nèi)引流術(shù)解除梗阻性黃疸優(yōu)于外引流術(shù)。

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