早孕期完整胚胎切片的制備方法

喬江麗，趙恩鋒，彭紅梅，宋 欣，陳 薇，鄧晉芳，田 俠

解放軍總醫院，北京 100853 1婦產科；2病理科

人類生殖器官和生殖細胞起源、發育的機制研究一直是生命科學中重要的研究課題。隨著國內外輔助生殖技術的不斷發展與應用，越來越多有關人類胚胎生殖系統發育方面的研究探索相繼開展。由于人胚的研究受到倫理、道德、宗教等諸多方面的制約，研究相對緩慢。20世紀后期美國學者Moore等[1]在研究人胚胎早期發育方面(從受精卵到胚胎形成及各系統的早期發育過程)取得了很大進展。丹麥學者Mollgard等[2]在探索生殖系統發育的祖細胞(即生殖細胞)的遷移等方面也取得初步進展。研究胚胎生殖系統發育過程依賴基本的病理技術操作，目前人類早期胚胎完整切片的制作方法及切片的鏡下特征等在國內外研究領域還是空白，生殖脊早期發育階段的形態特征還沒有報道。我們制作早期胚胎切片，目的是為今后研究人類生殖脊的起源、早期階段的形態特征和生殖細胞的起源、遷移等提供技術支持?，F將人類早期胚胎完整切片的制備過程報告如下。

材料和方法

1 胚胎的收集 經我院倫理委員會批準，征得孕婦同意，經簽署知情同意書。收集胎齡約為21-35d藥物流產胚胎。所用藥物對胚胎組織標本的制作無影響，且所用藥物流產胚胎均為已經死亡的胚胎。所選早孕婦女均經B超檢查確認為正常宮內早孕且尿妊娠陽性。胚胎齡的計算方法：選擇平素月經規律、周期為28-30d的早孕孕婦，按孕婦末次月經日減去14d，并結合胚胎發育的外部特征計算胎齡。

2 取材與固定 所有藥物流產的完整胚胎直接用4%甲醛固定。將胎囊在解剖顯微鏡下解剖，找到胎芽及卵黃囊，除去多余絨毛膜囊，取出完整胎芽及卵黃囊，濾紙包裹標記好方向及體位。進行常規脫水 (經 50%，70%，80%，90%，100%等梯度乙醇脫水)，二甲苯浸透，浸蠟(置于56-60℃熔化的石蠟中2-3h，使石蠟充分滲透組織內部)，液體石蠟包埋，切片與HE染色等步驟。光鏡下觀察人類早期胚胎形態結構特征并照相。

結 果

1 切片制備情況 藥流囊胚55例采用此方法制備胚胎完整切片，成功30例(成功率為55%)。剩余制備失敗的25例中有17例胎囊中未見到胎芽，8例由于胎芽過小過嫩，在進行夾取固定或石蠟包埋時組織遭到損壞，以至鏡下觀察時結構不典型，難以辨認。

2 大體標本 顯微鏡下大體標本可見完整胚胎及卵黃囊，胚胎呈新月狀，凹面為腹側，凸面為背側。腹側從上至下依次為頭部，心臟等結構；側面可見胚胎上肢芽和下肢芽；背側清晰可見脊柱成串排列。胚胎下方為圓形近透明的卵黃囊。見圖1。

3 HE染色鏡下形態結構 切片干凈，完整，能清楚辨認出胎兒頭部、心臟、肝臟等器官，脊柱成串排列，其他內臟器官如腎臟、生殖器官等(泌尿生殖嵴等還未開始發育)還未生成；卵黃囊呈不規則圓形。見圖2。

圖1 30d人胚胎鏡下大體標本(×12)藍色箭頭指示卵黃囊，紅色箭頭指示胎兒頭部，藍色三角指示心臟，紅色三角分別指示上下肢芽，黑色箭頭指示脊椎。圖2 30d人胚胎石蠟切片HE染色鏡下形態結構(×13)藍色箭頭指示卵黃囊，紅色箭頭指示頭部，紅色三角指示心臟區，黑色箭頭指示脊椎。Fig 1 Gross human embryo on day 30 of fertilization(original magnification ×12)Blue arrow indicates yolk sac, red arrow indicates fetal head, blue triangle indicates heart, red triangle indicates anterior limb bud and posterior limb bud, black triangle indicates vertebral column.Fig 2 Morphology of embyo on day 30 of fertilization after HE staining(original magnification ×13)Blue arrow indicates yolk sac, red arrow indicates fetal head, red triangle indicates heart, black triangle indicates vertebral column.

討 論

有關人類早期胚胎的認識及各階段形態特征的研究國外學者研究的較早，并取得了很大的成果[2]。在人類早孕期胚胎完整切片的制備方面有其獨特的方法，他們把胎齡為28-56d大小的人胚胎行磁共振成像攝片[3]，對人類早期胚胎生殖系統及內外生殖器官發育進程也有研究[4]。而國內目前主要集中于對鼠胚的研究，2003年有小鼠早期胚胎細胞切片制備的報道[5]，2004年劉曉蓉等報道采用石蠟切片完成對鼠胚生殖腺發育的形態學觀察研究[6]，2005年劉淑琴等報道制備出鼠胚不同階段的完整切片[7]，2009年制備出含中腎旁管的小鼠胚胎組織石蠟切片[8]。有關人早期胚胎的完整切片制備基本上還是一片空白，無相關報道。在用石蠟包埋制備完整人胚蠟塊的方法成功應用之前，我們也曾試過用瓊脂糖固定胚胎[9]，試圖精修后做石蠟切片，但是由于瓊脂糖的透明度及軟硬度不能達到滿意效果，不得不繼續尋找其他可行方法。

經過對此方法反復實驗研究，得出在進行人類早期胚胎切片的制備過程中需注意以下操作：1)要借助光源找到絨毛膜囊內的胎芽和卵黃囊，沒有光源很容易將其與絨毛組織混淆，甚至無法辨認；2)早孕期胎芽較小較嫩，操作必須非常輕柔仔細，否則極易將卵黃囊和胎芽破壞，失去其完整性；3)在用濾紙包裹固定時，不能直接夾取胎芽或卵黃囊，最好留一小部分絨毛膜囊便于操作；4)浸蠟后的包埋操作同樣要輕柔、仔細，認真辨認，避免直接夾取胎芽和卵黃囊組織?？傊麄€過程一定要非常輕柔、仔細，才可能確保胎芽和卵黃囊的完整性，也才可能得到完整的切片。切片制作成功率不是很高，一方面由于胚胎本身發育障礙所致只有空胎囊而沒有胎芽發育；另一方面由于早孕期胎芽組織極其脆嫩，給操作帶來很大不便，需要熟練的操作技術；另外操作時間過長也會影響胚胎組織的質量。

人類胚胎石蠟標本的制備，解決了標本保存的時間問題，可多次切片，簡單易行，對研究人類胚胎發育和輔助生殖技術都有重要意義。在今后的研究工作中，我們會不斷改良方法，制備出更好的人類胚胎發育各個階段的完整切片，以便觀察生殖器官的發育情況及形態變化特征。

致謝：婦產科趙玉梅、宋東芳、孫繼榮等醫學同仁，為我們的工作提供了很大的幫助和支持，在此向她們表示感謝！

1 Moore KL，Persaud TVN. Before we are born ：essentials of embryology and birth defects［M］. 4th. Philadelphia：Saunders，1993：26-299.

2 Mollgard K，Jespersen A，Lutterodt MC，et al. Human primordial germ cells migrate along nerve fibers and Schwann cells from the dorsal hind gut mesentery to the gonadal ridge［J］. Molecular Human Reproduction，2010，16（9）：621-631.

3 Matsuda Y，Ono S，Otake Y，et al. Imaging of a large collection of human embryo using a super-parallel MR microscope［J］. Magn Reson Med Sci，2007，6（3）：139-146.

4 Sajjad Y. Development of the genital ducts and external genitalia in the early human embryo［J］. Obstet Gynaecol Res，2010，36（5）：929-937.

5 呂廣艷，曲淑賢，申 健，等. 小鼠早期胚胎細胞超薄切片制備法［J］. 大連醫科大學學報，2003，25（1）：63-64.

6 劉小蓉，安靚，李進. 昆明胚鼠生殖腺發育的形態學觀察［J］.第一軍醫大學學報，2004，24（4）：414-418.

7 劉淑琴，秦建民，曾錦章，等. 不同時期小鼠胚胎整體石蠟標本的制備技術［J］. 解剖學雜志，2005，28（6）：721-723.

8 梁琳琳，朱桂金. 含有中腎旁管的小鼠胚胎組織石蠟切片制備［J］. 新鄉醫學院學報，2009，26（1）：1-3.

9 屈平平，田文儒，高善頌，等. 小鼠附植前胚胎超薄切片的瓊脂糖預包埋制備方法［J］. 中國獸醫科學，2008，38（3）：254-256.