比較卡鉑對乳腺癌細胞及血小板生成素作用下巨核細胞的影響

李自健，楊俊蘭，焦順昌，張 帆，謝文秀，游俊浩

1解放軍第161醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，湖北武漢 430012；2解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；3海軍總醫(yī)院特需醫(yī)療部，北京 100037

惡性腫瘤患者化療后常導致不同程度的血小板減少，以往臨床多采用輸血小板，目前臨床常在化療后使用血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)來治療[1-8]，但起效較慢[7]。國外有研究在化療前使用血小板生成素[9]，但目前臨床上對此有些擔心，是否會加重化療藥物對巨核細胞的抑制以及是否安全。本實驗通過觀察化療藥物卡鉑對乳腺癌細胞和使用TPO的巨核細胞的抑制率比較，模擬臨床上化療前使用TPO化療藥物對巨核細胞和腫瘤細胞的影響，間接了解化療前使用TPO是否安全。

材料和方法

1 主要材料 TPO(沈陽三生1ml：15 000U)，卡鉑注射液(齊魯公司10ml：100mg)，天津血研所提供的巨核細胞株MO7e細胞、解放軍總醫(yī)院腫瘤實驗室提供的人乳腺癌細胞系MDA-MB-453。

2 細胞培養(yǎng) 把MO7e細胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清和濃度20ng/ml的TPO)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人乳腺癌細胞系MDA-MB-453培養(yǎng)在RPMI-1640中(含10%胎牛血清)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3 TPO不同濃度對MO7e細胞的影響 取MO7e細胞，把細胞濃度調(diào)為2×105/ml，把細胞分10組，每組5個復孔，接種在96孔板中，濃度為每孔2×104/100μl，分別加入0、4、8、16、32、64、128、256、512μg/L濃度的TPO，相同方法重復接種3個96孔板，各培養(yǎng)24h、48h、72h，然后每孔加入MTT 20μl，4h后每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO)，使用酶標儀于492nm波長處測定吸光度值(A)，計算MO7e細胞增殖率。公式=(實驗組A值-對照組A值)/對照組A值×100%，作出增殖曲線，以上實驗全部重復3次。

4 卡鉑對加入TPO的MO7e細胞的抑制率 取MO7e細胞，洗滌2次，懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清和256ng/ml的TPO)，細胞濃度調(diào)為2×105/ml。把細胞分成9組，每組6個復孔，濃度為2×104/100μl/孔接種在96孔板中，分別加入0到2 000μg/ml濃度的卡鉑，相同方法重復接種2個96孔板，各培養(yǎng)24h和48h后，然后每孔加入MTT 20μl，4h后每孔加入100μl的DMSO，使用酶標儀于492nm波長處測定吸光度值(A)，計算抑制率。公式=1-(實驗組A/對照組A)，作出卡鉑對MO7e細胞作用曲線，以上實驗全部重復3次。

5 卡鉑對乳腺癌細胞系的抑制率 取乳腺癌細胞，細胞濃度為1.5×105/ml，分成7組，每組設6個復孔，濃度為1.5×104/100μl/孔接種在96孔板中，培養(yǎng)24h細胞貼壁后，1-7組分別加入0到800μg/ml濃度的卡鉑，相同方法重復接種2個96孔板，各培養(yǎng)24和48h后，每孔加入MTT 20μl，4h后棄上清，每孔加入150μl的DMSO，使用酶標儀于492nm波長處測定吸光度值(A)，計算抑制率。作出卡鉑對乳腺癌細胞作用曲線，以上全部實驗重復3次。

6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用-x±s表示，用SPSS17.0軟件統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)，相關性檢驗使用秩和相關檢驗，多組間比較使用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 TPO濃度變化對MO7e細胞的影響 MO7e細胞增殖率隨TPO濃度增大而增大，TPO濃度達到256ng/ml時，細胞的增殖率達到最大，同時也達到平臺期，濃度達到512ng/ml時細胞增殖率不再增大，取256ng/ml為TPO實驗濃度。見圖1。

2 卡鉑對MO7e細胞的抑制率 隨著卡鉑濃度增大，對MO7e細胞的抑制率也增加，呈正相關。各實驗組的抑制率與對照組(卡鉑濃度為0μg/ml)相比P<0.01，同時作圖求得卡鉑對MO7e細胞的IC50，作用24h后IC50=4 000μg/ml，作用48h后IC50=1 600μg/ml，見表1、圖2。

3 卡鉑對乳腺癌細胞的抑制率 隨著卡鉑濃度增大，對乳腺癌細胞的抑制率也增大，呈正相關。各實驗組的抑制率與對照組(卡鉑濃度為0μg/ml)相比P<0.01，作圖求得卡鉑對乳腺癌細胞的IC50，作用 24h后 IC50=400μg/ml，作用 48h后IC50=120μg/ml，見表2、圖3。

4 卡鉑對MO7e細胞和乳腺癌細胞的抑制率比較卡鉑對乳腺癌細胞的IC50遠遠小于對MO7e細胞的IC50，差異達10倍左右，表明卡鉑對乳腺癌細胞的抑制率遠遠大于對MO7e細胞的抑制率，見表3。

表1 卡鉑作用24h和48h對MO7e細胞抑制率變化Tab 1 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MO7e cells at 24 and 48h(-x±s, n=6)

表2 卡鉑作用24h和48h對乳腺癌細胞抑制率變化Tab 2 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MDAMB-453 cells at 24 and 48h(-x±s, n=5)

表3 卡鉑對MO7e細胞和乳腺癌細胞的IC50比較Tab 3 Effect of CBP on IC50 of MO7e cells and MDA-MB-453 cells(μg/ml)

圖1 加入TPO 不同時間細胞增殖率的變化Fig 1 Effect of TPO on proliferation rate of MO7e cells at different time points

圖2 卡鉑作用24h和48h對MO7e細胞抑制率變化Fig 2 Inhibitory effect of CBP on proliferation rate of MO7e cells at 24 and 48h(-x±s, n=6)

圖3 卡鉑作用24h和48h對乳腺癌細胞抑制率變化Fig 3 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MDA-MB-453 cells at 24 and 48h(-x±s, n=5)

討 論

本實驗用MO7e巨核細胞株替代巨核細胞，MO7e細胞能表達血小板特異性的表面標志物，其表面有TPO受體c-Mpl，并且其生長需TPO支持。人類骨髓中巨核細胞數(shù)量非常少，通過實驗方法分離和純化比較困難，并且不易在體外長期培養(yǎng)，因此MO7e細胞株替代巨核細胞，目前是最佳研究TPO對巨核細胞影響的替代細胞[10]。

本實驗觀察到TPO能促進巨核細胞增殖，呈濃度依賴性，TPO濃度256ng/ml時達到平臺期。通過卡鉑對乳腺癌細胞以及對加入TPO的巨核細胞IC50比較，卡鉑對乳腺癌細胞的抑制率遠遠大于對加入TPO巨核細胞的抑制率，提示化療前使用TPO可能是比較安全的。因本實驗是體外實驗，與體內(nèi)實驗尚有一定差距，還需進一步臨床實驗。

1 Vadhan-Raj S，Verschraegen CF，Bueso-Ramos C，et al.Recombinant human thrombopoietin attenuates carboplatin-induced severe thrombocytopenia and the need for platelet transfusions in patients with gynecologic cancer［J］. Ann Intern Med，2000，132（5）：364-368.

2 Vadhan-Raj S. Recombinant human thrombopoietin in myelosuppressive chemotherapy［J］. Oncology（Williston Park），2001，15（7 Suppl 8）：35-38.

3 魏燕，陳堅，徐周敏.重組人血小板生成素治療實體腫瘤患者化療后血小板減少的臨床觀察［J］. 中國癌癥雜志，2009，19（9）：705-707.

4 鞠艷芳，李方，趙宏，等. 重組人血小板生成素治療實體瘤化療所致血小板減少的臨床觀察［J］. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2009，17（5）：937-938.

5 侯繼院，劉興安，單國用，等. 重組人血小板生成素治療進展期胰腺癌化療后血小板減少的臨床觀察［J］. 臨床薈萃，2011，26（11）：976-977.

6 蔡銳剛，徐兵河，黃鏡. 重組人血小板生成素預防化療引起血小板減少癥的臨床觀察［J］. 中華腫瘤防治雜志，2009，16（9）：707-709.

7 Schiffer CA，Miller K，Larson RA，et al. A double-blind，placebo-controlled trial of pegylated recombinant human megakaryocyte growth and development factor as an adjunct to induction and consolidation therapy for patients with acute myeloid leukemia［J］. Blood，2000，95（8）：2530-2535.

8 王理揚，蒙榮欽，張瑜，等. 重組人血小板生成素治療腫瘤化療后血小板減少的臨床觀察［J］. 華西醫(yī)學，2010，25（9），1686-1688.

9 Vadhan-Raj S，Patel S，Bueso-Ramos C，et al. Importance of predosing of recombinant human thrombopoietin to reduce chemotherapy-induced early thrombocytopenia［J］. J Clin Oncol，2003，21（16）：3158-3167.

10 Broxmeyer HE，Cooper S，Hague N，et al. Human chemokines：enhancement of specific activity and effects in vitro on normal and leukemic progenitors and a factor-dependent cell line and in vivo in mice［J］. Ann Hematol，1995，71（5）：235-246.