熱灼聯合液氮冷凍建立兔中晚期股骨頭缺血性壞死動物模型

李富強，寧亞功，張恩龍，徐文漭，李峻輝

1解放軍總醫院/軍醫進修學院，北京 100853；2成都軍區昆明總醫院，昆明 650032

股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)是臨床常見的高度致殘性疾病。該病病因不明，目前臨床多以原發性和繼發性[1]進行大致區分。建立理想的股骨頭壞死動物模型，是進行股骨頭壞死治療研究的基礎[2]。目前常用的激素型、乙醇型、液氮冷凍、微波滅活、截骨融合等模型的建立，與臨床ANFH的病因和病理過程仍有很大差異。本實驗在借鑒既往成功經驗的基礎上，旨在探討中晚期(FicatⅢ-Ⅳ期)兔ANFH動物模型的建立，縮短造模時間，為中晚期ANFH的治療研究提供一種合適的動物模型。

材料和方法

1 實驗動物 5月齡日本大耳白兔20只，雌雄不限，體質量2.7-3.0kg，由昆明醫學院動物實驗中心提供。許可證號：SYXK(滇)2005-0008。實驗過程中對動物處置符合2006年科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[3]。

2 藥品與儀器 戊巴比妥鈉，購自上海艾研生物科技有限公司；液氮，由昆明總醫院供氧中心提供；可控溫電烙鐵，由昆明總醫院醫學工程科改制；雙能X線骨密度檢測儀，購自法國Medllink Osteocore3；核磁共振掃描儀，購自德國Siemens Verio 3.0T。

3 造模方法 取20只兔，左后肢用于造模，右側對照。戊巴比妥鈉30mg/kg耳緣靜脈注射麻醉后，以大轉子體表標記點為中心，直徑5cm備皮，取右側臥位固定，常規消毒術野、鋪洞巾，仍以大轉子為中心在髖關節外側沿股骨方向作長約3cm切口，于肌間隙逐層切開直達關節囊，環股骨頸切開關節囊，牽引股骨并內收暴露股骨頭，顯露股骨頭負重區，注意保護股骨頭韌帶，防止髖關節脫位，預熱電烙鐵，當溫度達100℃時電源自動斷開，將烙鐵頭置于股骨頭負重面持續2min，操作中注意保護周圍組織，而后以液氮棉簽連續快速冷凍股骨頭25次，10s/次。自然復溫后用0.9%氯化鈉溶液清洗，逐層縫合術口。手術當日及術后3d術口周圍肌肉注射青霉素80萬U/d，預防感染。4 觀察指標 1)一般情況：動物的精神狀態、術口愈合情況、進食、排泄及造模側肢體活動情況。2)X線、MRI：手術后觀察髖關節、股骨頭形態，骨密度及骨小梁變化，了解股骨頭壞死情況。3)股骨頭標本大體觀察：關節囊變化，股骨頭外形、顏色，關節面等情況。4)組織病理學觀察：股骨標本放入4%甲醛溶液中固定，取出標本自來水沖洗3遍，放入10%硝酸水溶液中脫鈣4-6h，直至針刺入組織無阻力感為止；乙醇梯度脫水后置于二甲苯中透明，標本浸蠟，包埋于蠟塊。切片行HE(蘇木素-伊紅)染色。

結 果

1 一般情況 術后3d始所有實驗動物精神恢復，進食、排泄正常，術口5d左右完全愈合，未發生髖關節脫位。術后4周左右大部分動物出現患肢活動受限，麻醉后被動活動患肢可感覺外展、后伸不同程度受限。

2 X線檢查 造模1周后造模側股骨頭外形圓，骨密度無明顯變化，骨小梁結構正常；2周時股骨頭外形圓，骨密度稍增加，骨小梁結構完整，髖關節間隙模糊；4周時股骨頭輕度變扁，表面欠光滑，有囊性結構形成，出現硬化帶，骨小梁結構紊亂；6周時股骨頭外形變扁，表面毛糙，骨密度明顯增加，局部有輕度塌陷征象；8周時髖關節周圍發生增生，股骨頭變小，關節面塌陷。見圖1。3 MRI檢查 術后1周未見明顯信號異常，關節腔內少量積液；術后2周可見壞死區在T1WI上為中低信號，在T2WI上呈較高信號，周圍環繞線樣低信號，毗鄰區域可見骨髓水腫；4周為低信號圍繞的信號不均壞死區，呈散在、點狀分布于股骨頭內；6周時股骨頭脂肪高信號中出現不同形態的低信號區，呈環形、帶狀和灶狀；8周時表現為骨性關節炎改變，間隙變窄，關節面骨質增生，邊緣骨贅形成。見圖2。

4 大體觀察 造模1周后實驗側股骨頭承重面失去了正常的淡粉紫色，呈灰白色改變，與正常組織之間有明顯界限；2周后股骨頭灰白色面積縮小，與正常組織之間界限模糊，關節面尚光滑；4周時股骨頭稍變扁，關節軟骨表面毛糙，部分出現剝脫；6周時股骨頭明顯變扁，關節軟骨剝脫嚴重，關節面塌陷；8周時關節面進一步塌陷，股骨頭變小，環塌陷區出現了明顯的增生組織。見圖3。

5 組織病理學觀察 造模1周后關節軟骨局部出現壞死，成骨區骨小梁排列基本正常，局部區域骨陷窩變空，骨細胞消失，髓腔內組織出現壞死；2周后關節面軟骨變薄、結構不連續，部分區域變性壞死，軟骨下方骨小梁纖細，排列紊亂，髓腔內片狀骨髓造血細胞凝固性壞死及骨髓脂肪組織液化性壞死；造模4周后關節面軟骨破壞加重，軟骨下骨質出現修復跡象；6周后關節面軟骨損害繼續擴大，部分區域出現修復跡象，形成同源細胞群，未能修復區域由增生的纖維組織代替，軟骨下骨小梁壞死、斷裂，形成死骨，髓腔內纖維組織增生；造模8周后軟骨進一步塌陷伴軟骨下肉芽組織增生，成骨區骨小梁大片骨壞死及髓腔內纖維化。見圖4。

討 論

目前與ANFH有關的因素大約有60余種[4]，臨床上大致可分為外傷性和非外傷性兩大類[5]，外傷性主要是由于骨折或脫位導致股骨頭供血血管損傷，直接導致骨缺血壞死；非外傷性病因的致病機制比較復雜，或為多種因素協同作用的結果。為尋求理想的治療研究對象，前人對股骨頭壞死動物模型的建立進行了很多探討，主要以全身激素型和局部液氮冷凍型為主[6]，孔令擘[7]等對上述兩種主要造模方法進行比較，認為激素的方法并非一定能引起股骨頭壞死，而液氮冷凍方法建立的兔股骨頭缺血壞死模型方法簡便、壞死明顯。且使用激素僅能復制早期的病理改變[8]。對實驗動物的選擇也非常廣泛，朱建龍[9]等認為符合人類股骨頭壞死病變的病理過程、模型有良好的可重復性、動物的解剖和生理特點盡可能與人類相似、經濟可行是選擇實驗動物的原則，因此筆者選擇兔作為實驗動物。目前沒有一種方法能夠完全模擬人ANFH發病過程[10]，但只要模擬出病理過程中的某些重要特征也會對治療研究產生意義。

圖1 造模后1(A)、4(B)、8(C)周X線表現Fig 1 X-ray findings at weeks 1(A), 4(B), and 8(C) after operation

圖2 造模后1(A)、4(B)、8(C)周MRI表現Fig 2 MRI findings at weeks 1(A), 4(B), and 8(C) after operation

圖3 造模后正常側與實驗側股骨頭大體比較A：術后1周；B：術后4周；C：術后8周Fig 3 Gross findings in normal and experimental sides of femoral head at weeks 1(A), 4(B), and 8(C) after operation

圖4 造模后組織病理學觀查A：術后1周；B：術后4周；C：術后8周Fig 4 Histopathological findings at weeks 1, 4, and 8 after operation

以往股骨頭壞死保髖治療的目標重在骨的固有病變，忽略了關節軟骨的情況。本實驗是模擬中晚期ANFH關節面塌陷、軟骨破壞的病理過程，為中晚期股骨頭壞死的治療研究提供適宜的動物模型。本實驗在以往常規液氮冷凍致股骨頭壞死單因素造模的基礎上，加入了促進股骨頭軟骨壞死、剝離的因素。范猛[11]等采用局部冷熱交替損傷建立鴯鹋股骨頭壞死塌陷模型，認為在造成骨壞死方面使用冷熱交替的方式優于使用單純冷凍的方式。朱曉松等[12]采用將微波天線插入兔股骨頭內對股骨頭滅活10min的方法成功造成股骨頭壞死模型，通過實驗得出最佳作業溫度為55℃，本實驗選擇作業溫度為100℃，一則是由于烙鐵頭置于股骨頭軟骨表面而非股骨頭內，二則微波天線不適用于本方法操作，且電烙鐵最低可調溫度為100℃，溫度再高可能會導致軟骨下骨質的嚴重損傷、壞死面積無法控制。在軟骨表面熱灼的適宜溫度今后還可進一步研究探討。

在實驗初期我們嘗試對部分造模后的實驗動物進行螺旋CT檢查，結果造模后4周以前的動物股骨頭在CT掃描下無特殊發現，而造模2周以后的動物在MRI掃描時股骨頭內已有明顯改變，霍現英[13]等研究表明MRI對于早期股骨頭壞死的診斷最敏感、特異性高。因此本實驗采用西門子公司3.0T磁共振儀掃描作為實驗動物的重要造模評價，能夠早期發現股骨頭病變，同時結合X線檢查，總體把握股骨頭外形變化。

綜上所述，熱灼聯合液氮冷凍法能夠模擬出中晚期ANFH關節軟骨破壞、軟骨下骨質塌陷、骨性關節炎形成的病理過程，且具有造模時間短、動物死亡率低、造模成功率高的優點，可為中晚期ANFH的治療研究提供適宜的動物模型。

1 肖正權.股骨頭壞死病學［M］. 1版.北京：人民軍醫出版社，2007：63.

2 戴雙武，丁帥，李章華，等. 液氮冷凍法制作兔股骨頭壞死模型：可行，理想與可信［J］. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（2）：276-279.

3 中華人民共和國科學技術部.關于善待實驗動物的指導性意見［S］. 國科發財字〔2006〕398號.

4 趙德偉.股骨頭缺血性壞死的修復與再造［M］. 2版.北京：人民衛生出版社，2008：32.

5 馬坤，顧建平.股骨頭壞死動物模型制作方法的研究進展［J］.中國介入影像與治療學，2009，6（3）：286-289.

6 鄧冰，權毅，潘顯明，等.液氮注射制作兔股骨頭缺血性壞死模型實驗研究［J］. 西南國防醫藥，2009，19（3）：264-266.

7 孔令擘，牛舜，楊重飛，等. 兔股骨頭缺血壞死模型的建立研究及比較［J］. 第四軍醫大學學報，2009，30（2）：138-141.

8 呂維富，侯昌龍，魯東，等. 采用經導管動脈栓塞術建立豬股骨頭缺血性壞死模型［J］. 中國介入影像與治療學，2011，8（5）：439-442.

9 朱建龍，趙紅昌. 液氮冷凍法誘導犬股骨頭缺血性壞死模型MRI影像與病理觀察［J］. 中醫正骨，2011，23（6）：21-24.

10 劉國柱，楊彤濤，韓建偉，等. 改良式液氮冷凍法制備犬股骨頭壞死動物模型［J］. 南方醫科大學學報，2009，29（8）：1602-1604.

11 范猛，汪愛媛，王玉，等. 局部冷熱交替損傷建立鴯鹋股骨頭壞死塌陷模型［J］. 中國醫學科學院學報，2011，33（4）：375-381.

12 朱曉松，李彥林，耿承奎，等. 微波滅活兔股骨頭壞死模型建立的實驗研究［J］. 昆明醫學院學報，2009，（3）：63-67.

13 霍現英，張玉祥，陳國忠，等. 股骨頭缺血性壞死的MRI診斷［J］. 中國CT和MRI雜志，2005，3（1）：51-53.