不同抗凝劑和激活劑組合在自體富血小板血漿凝膠支架促進(jìn)脂肪干細(xì)胞增殖的影響

張 寧，李 放，羅 濤

1北京軍區(qū)總醫(yī)院 骨科，北京 100700；2解放軍總醫(yī)院/軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，北京 100853

富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)是全血經(jīng)濃集后分離得到的血液制品[1-2]。通常認(rèn)為血小板濃度達(dá)到全血的4倍即可稱為富血小板血漿。其富含高濃度促進(jìn)骨組織和軟組織再生修復(fù)的生長(zhǎng) 因 子 TGF-β1、TGF-β2、EGF、FGF、PDGF、VEGF、IL-1[3-5]。而富血小板血漿最大優(yōu)勢(shì)在于其來(lái)源于患者自身，無(wú)免疫原性，使其在組織工程應(yīng)用中有顯著優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用富血小板血漿PRP復(fù)合脂肪干細(xì)胞(adipose derived stromal cells，ADSCs)支架材料，構(gòu)建組織工程髓核，治療椎間盤退變性疾病的臨床應(yīng)用提供方法。目前國(guó)內(nèi)外抗凝劑和激活劑選擇尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)在制作自體PRP支架并植入ADSCs過(guò)程中，使用不同抗凝劑(肝素、EDTA)和激活劑(凝血酶、Ⅰ型膠原)，探討各組之間ADSCs生長(zhǎng)情況的差異性，為體內(nèi)試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 取3月齡新西蘭雄性大白兔10只，體質(zhì)量2.0-2.5kg，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。在制作自體PRP支架并植入ADSCs過(guò)程中，每1.0ml L-DMEM完全培養(yǎng)基中含使用不同抗凝劑(肝素、EDTA)和激活劑(牛凝血酶、Ⅰ型膠原)PRP，EDTA與凝血酶組，EDTA與Ⅰ型膠原組，肝素與凝血酶組，肝素與Ⅰ型膠原組，空白對(duì)照組，L-DMEM完全培養(yǎng)基中不含PRP。

2 脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 將成年新西蘭大白兔以3.0%戊巴比妥鈉(1.0ml/kg)耳緣靜脈麻醉，取兔肩胛間區(qū)皮下脂肪。參照馬健[6]等文獻(xiàn)的方法進(jìn)行脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定，取第3代脂肪干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 富血小板血漿制備 用注射器從兔耳中央動(dòng)脈抽血分別取5ml移入兩組抗凝管(EDTA抗凝管和肝素抗凝管)中。采用二次離心法先以2 400r/min，離心10min，超凈臺(tái)內(nèi)用槍頭吸取全部上清液以及白膜層，加入離心管中，再次以3 600r/min離心15min，，棄掉約3/4上清液，剩余液體即為PRP，約0.5ml[6]。制備PRP凝膠前需分別于兩組激活劑混和。以10ml PRP加入牛凝血酶(Sigma，USA)60U和1ml 10% CaCl的比例混合。I型膠原(Sigma，USA)20μg/ml，并用碳酸氫鈉緩沖至pH 7.4[7]。

4 脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力測(cè)定 取第3代脂肪干細(xì)胞按1 000個(gè)/孔接種到7塊96孔板內(nèi)，用不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使其同步化后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，將每塊板上的孔隨機(jī)分為5組，每組6孔(共用30個(gè)孔)，根據(jù)不同分組分別加入相應(yīng)L-DMEM培養(yǎng)基，分別37.8℃培養(yǎng)7d，每天計(jì)數(shù)1塊板，連續(xù)觀察7d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。用MTT法在第2、3、4、6天檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖能力。在每孔內(nèi)加入5mg/ml MTT液50μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去MTT液，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩5min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀法測(cè)定吸光度A值(490nm)，每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)量6次，取平均值。

5 各組TGF-β1，Ⅱ膠原及sox-9含量測(cè)量 1)TGF-β1的測(cè)量：通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)定量檢測(cè)TGF-β1的含量。具體操作遵循操作手冊(cè)。所有OD值都減除零孔值后再行計(jì)算；以標(biāo)準(zhǔn)品 1 000、500、250、62.5、31、15.6、0ng/ml之OD值在雙對(duì)數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相對(duì)應(yīng)TGF-β1的濃度。2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)定量檢測(cè)細(xì)胞的Ⅱ膠原：取第3代脂肪干細(xì)胞按2×104個(gè)/孔的濃度在96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，用不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使其同步化后棄去培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，將每塊板上的孔隨機(jī)分為5組，每組6孔(共用30個(gè)孔)，根據(jù)不同分組加入含不同抗凝劑和激活劑PRP的L-DMEM培養(yǎng)液，3d后PBS清洗，體積分?jǐn)?shù)2%甲醛固定，體積分?jǐn)?shù)0.3%過(guò)氧化氫中和內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入Ⅱ膠原抗體，室溫下孵育60min，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗30min后，用0.25mol/L的硫酸中止反應(yīng)，每孔100μl的樣品轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在吸光度450nm(A450nm)條件下測(cè)量膠原的產(chǎn)生。通過(guò)realtime RT-PCR測(cè)量sox-9基因含量，把脂肪干細(xì)胞加入向軟骨分化培養(yǎng)液(Cambrex公司)中培養(yǎng)21d并在前7天加入PRP。實(shí)時(shí)定量RT-PCR是使用ABI PRISM7900檢測(cè)系統(tǒng)。用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA樣本用于PCR分析[8]。使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化曲線法進(jìn)行量化和規(guī)范化的內(nèi)部控制。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用-x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血小板計(jì)數(shù) 全血為(181.75±41.44)×109/L，使用EDTA抗凝管PRP中含的血小板含量(1 040.01±159.72)×109/L約為全血的5.7倍。使用肝素抗凝管PRP中含的血小板含量(795.01±140.69)×109/L約為全血的4.2倍。

2 ADSCs生長(zhǎng)曲線及增殖情況 各組脂肪干細(xì)胞均有增長(zhǎng)且隨著時(shí)間點(diǎn)增長(zhǎng)。在培養(yǎng)第2天各組細(xì)胞數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，可能與細(xì)胞處于G0靜止期有關(guān)，在第3-7天，各組細(xì)胞數(shù)有明顯增長(zhǎng)，并且加入PRP的各組與空白對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)，表明細(xì)胞處于快速生長(zhǎng)期。但第3天PRP各組間差異不明顯(P>0.05)，在第4-7天EDTA-凝血酶組與其他各組相比細(xì)胞數(shù)明顯較高(圖1)。MTT法也顯示各組PRP細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組相比均有增加，在培養(yǎng)第6天，EDTA-凝血酶組細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組升高約2.5倍。見(jiàn)表1。

3 各組TGF-β1、Ⅱ膠原及sox-9含量 在基因表達(dá)方面，我們發(fā)現(xiàn)軟骨分化標(biāo)志物sox-9增長(zhǎng)更加明顯(最高約為8倍)，而TGF-β1(最高約為5.8倍)，Ⅱ型膠原(最高約為1.8倍)。各PRP組sox-9的基因相對(duì)于管家基因18s表達(dá)量分別為30.11±4.03，25.78±5.24，26.53±6.05，22.77±4.33，空白對(duì)照組為3.75±0.21(P<0.01)。TGF-β1表達(dá)量分別為289.83±24.36，203.4±33.11，205.71±48.54，198.71±19.01，空白對(duì)照組為50.71±10.17 (P<0.05)。Ⅱ型膠原表達(dá)量分別為0.54±0.04，0.48±0.03，0.48±0.02，0.46±0.03，空白對(duì)照組為0.30±0.02(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

表1 MTT法測(cè)定各組脂肪干細(xì)胞增殖能力Tab 1 Proliferation of ADSC in different groups detected by MTT assay(-x±s, %)

圖1 各組別脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖Fig 1 Growth curves of bone ADSC in different groups

討 論

富血小板血漿中含高濃度的生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及組織修復(fù)。研究顯示富血小板血漿可促進(jìn)干細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其向成骨、軟骨及脂肪細(xì)胞等多個(gè)方面轉(zhuǎn)化，也可刺激軟組織再生，并促進(jìn)傷口早期愈合。富血小板血漿凝膠是三維的多孔結(jié)構(gòu)，具有一定的黏附性，這有利于脂肪干細(xì)胞黏附生長(zhǎng)、防止生長(zhǎng)因子流失，并能保持局部較高的生長(zhǎng)因子濃度[9]。本文使用的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)種子細(xì)胞有以下優(yōu)勢(shì)：首先取材簡(jiǎn)便，成本低廉；其次與骨髓干細(xì)胞相比，其在生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞老化、基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞的黏附特性等方面無(wú)明顯差別。目前已證實(shí)脂肪干細(xì)胞在一定條件下能夠向中胚層細(xì)胞系包括脂肪、軟骨、骨、肌肉和其他胚層細(xì)胞系包括神經(jīng)、內(nèi)皮等轉(zhuǎn)化。

PRP再生潛力是基于血小板破裂時(shí)生長(zhǎng)因子的釋放，因此制作PRP時(shí)要求使用的抗凝劑盡量減少對(duì)血小板的損傷，保持血小板的生理活性。陳小玲等[10]報(bào)道了不同濃度凝血酶對(duì)富血小板血漿促骨髓基質(zhì)的影響，研究顯示在使用凝血酶時(shí)，20、40、60U/ml促增殖作用呈濃度依賴關(guān)系，且60U/ml組作用明顯高于其他各組。鄧新立等[11]報(bào)道了不同濃度血小板激活劑激活血小板微粒膜表達(dá)PAC-1、CD62p的比較，結(jié)果顯示隨著激活劑濃度的增加，CD62p+PMP、PAC-1+PMP的百分率都在逐漸增加。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)抗凝劑和促凝激活劑并無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)研究的目的是找出最佳的抗凝劑和激活劑組合。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以得出結(jié)論：EDTA與凝血酶組別自體富血小板血漿(PRP)對(duì)促進(jìn)脂肪干細(xì)胞增殖效果最好，是最佳的抗凝劑和激活劑組合。

綜上所述，本研究將抗凝劑和激活劑兩種變量進(jìn)行聯(lián)合研究，更好地探索多變量情況下PRP對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響以及自身釋放生長(zhǎng)因子的影響，也彌補(bǔ)了以往實(shí)驗(yàn)中只對(duì)單一變量的研究，忽略了試劑間的協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng)，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)論證，為下一步體內(nèi)試驗(yàn)試劑的選擇提供了依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于抗凝劑和促凝劑的種類太少，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作要求高，但限于實(shí)驗(yàn)條件以及工作量，有可能忽略了其他更好的試劑。由于本實(shí)驗(yàn)是動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否與人類相似，或者有可能相反，需進(jìn)一步研究。

圖 2 各組別TGF-β1、Ⅱ膠原量和sox-9基因的表達(dá)量Fig 2 Expression of markers of TGF-β1, col1gen-2 and sox-9 1: EDTA and thrombin; 2: EDTA and collagenⅠ; 3: Heparin and thrombin; 4: Heparin and collagenⅠ; 5: Control group

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