Bcl2-siRNA提高人肺腺癌細胞A549/DDP對順鉑敏感性的研究

張學林，余秉翔

解放軍總醫院 呼吸科，北京 100853

siRNA(small interfering RNA)是一種長約21-25bp的小RNA分子，由Dicer(RNAse Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)加工而成，是RNA干擾(RNA interference，RNAi)途徑中的中間產物，siRNA通過與一系列特異性蛋白質結合形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，再由RISC切割靶mRNA最終導致翻譯受阻，產生轉錄后基因沉默效應(PTGS)。在細胞內，siRNA能在低于反義核苷酸幾個數量級的濃度下，使靶基因表達水平降低，甚至可達完全“敲除”的效果[1]。肺癌在我國的發病率與死亡率已居惡性腫瘤之首，其中非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占80%以上，其五年生存率僅8%-10%，65%患者診斷時已為晚期[2]。鉑類藥物聯合其他化療藥物是治療NSCLC的主要方案，但是多藥耐藥現象影響化療療效[3-4]。越來越多研究表明Bcl-2基因與腫瘤耐藥關系密切。本研究以人肺腺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP及其親本細胞A549為模型，通過siRNA降低腫瘤細胞中Bcl2 mRNA及蛋白的表達，進而增加A549/DDP細胞對順鉑的敏感性，為研究肺癌順鉑耐藥提供依據。

材料和方法

1 試劑與儀器 注射用順鉑(凍干型)為齊魯制藥產品；jetPRIME轉染試劑購于PolyPlus-transfection公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自DOJINDO公司；TRI Reagent購自Sigma公司；反轉錄試劑盒購于Promega 公司；熒光PCR試劑購于TaKaRa公司；Bcl-2、GAPDH抗體購于Santa Cruz公司。siRNA由上海吉瑪公司合成(Negative Control RNA序 列 為 ：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。siBcl-2序 列[5]為 ：5'-UGUGGAUGACUGAGUACCUGAdTdT-3'，5'-UCAGGUACUCAGUCAUCCACAdTdT-3')； 其 余試劑均為進口分裝或國產分析純。Mx3000p熒光實時定量PCR儀由Stratagene生產；MS酶標儀由芬蘭Labsystems生產。

2 細胞株培養 人肺腺癌順鉑耐藥細胞株A549/DDP及其親本細胞株A549(ATCC)購于中國醫學科學院腫瘤研究所。細胞用RPMI-1640培養液加含10%胎牛血清(Hyclone)和100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，于37℃、5% CO2孵箱中孵育。為保持A549/DDP細胞耐藥性，在新鮮配置的含1μg/ml順鉑培養液中培養，常規消化、傳代。實驗前2d，A549/DDP細胞培養液換為不含順鉑培養液。

3 測定A549/DDP耐藥系數 取對數生長期的A549/DDP細胞和A549細胞鋪于96孔板，每孔3.0×103個細胞，16h后換為含不同濃度順鉑的培養液，A549培養液順鉑濃度為(0、0.5、1、1.5、2、3μg/ml)，A549/DDP培養液順鉑濃度為(0、3、6、9、12、15μg/ml)，每個濃度5個復孔。藥物作用48h后，換為新鮮配置的含10% CCK-8液的培養液100μl，置孵箱繼續培養，1h后用多功能酶標儀于450nm波長下檢測每孔吸光度值(A)。按公式計算每個濃度的順鉑對細胞生長的抑制率(IR)：IR(%)＝(1-Ai/A0)×100%(Ai為各濃度順鉑組的平均吸光值，A0為不加順鉑組的平均吸光值)。并計算順鉑對細胞的半數抑制濃度(IC50)。耐藥系數RI=IC50A549/DDP/IC50A549。實驗重復3次，取平均值。

4 轉染 取對數生長期A549/DDP細胞接種于6孔板，每孔1.0×105個細胞，接種16h后采用jetPRIME轉染試劑，按說明書進行轉染。每孔轉染雙鏈RNA終濃度為20nmol/L。轉染24h后換為不含順鉑的正常培養液。實驗分陰性對照組(NC組)和轉染siBcl-2組。

5 Real time RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA的表達水平總RNA的提取采用TRI Reagent法，按照說明書進行。總RNA提取后逆轉錄為cDNA，按照說明書操作。以GAPDH為內參照擴增Bcl-2基因。GAPDH上 游 引 物：5'-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3'， 下 游 引 物：5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'。Bcl-2上 游 引 物：5'-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3'， 下 游 引 物：5'-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3'。用2-ΔΔCt方法處理實時定量數據，計算Bcl-2 mRNA的表達差異。實驗重復3次，取平均值。

6 細胞凋亡檢測 細胞轉染32h后，接種于96孔板，每孔3.0×103個細胞，接種16h后換為新鮮配置的含不同濃度順鉑的培養液(0、3、6、9、12、15μg/ml)，藥物作用48h后，按方法3測吸光度A值，并計算兩組的IC50值，比較轉染siBcl-2后A549/DDP對順鉑敏感性的變化。實驗重復3次，取平均值。

7 Western Blot檢測Bcl-2蛋白的表達 用RIPA裂解液收集轉染后細胞，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，利用10%的SDS-PAGE膠進行分離等量蛋白，然后轉膜、封閉，加入1∶1 000稀釋的兔抗人Bcl-2單克隆抗體，以及1∶5 000稀釋的二抗。最后加入發光試劑，曝光、顯影。以GAPDH為內參照。

8 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，計量數據以-x±s表示，兩組獨立樣本采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 A549/DDP細胞耐藥系數測定 加藥48h后，順鉑(DDP)對A549及A549/DDP細胞的增殖均有抑制作用(圖1、2)。順鉑對A549細胞的IC50值為(1.68±0.26)μg/ml，對A549/DDP細胞的IC50值為(10.92±1.15)μg/ml，A549/DDP細胞的耐藥系數為6.49(P<0.05)(圖3)。

2 Bcl-2 mRNA及蛋白在A549及A549/DDP細胞中的差異表達 提取細胞中RNA后，通過逆轉錄及Real time RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA的表達。Bcl-2 mRNA在A549/DDP細胞中的表達水平是A549細胞的3.77±0.56倍(P<0.05)(圖4)。收集6孔板中A549及A549/DDP細胞，以GAPDH為內參照，檢測兩者之間Bcl-2蛋白的差異，由圖5示，A549/DDP細胞中Bcl-2蛋白表達明顯高于A549細胞。

3 siBcl-2的干涉效果 在A549/DDP細胞中轉染雙鏈RNA 48h后，siBcl-2組同NC組相比，Bcl-2 mRNA表達水平降低了92.6%(P<0.05)(圖6)，其蛋白表達也明顯降低(圖7)，幾乎達到“敲出”該基因的效果，說明其干涉效果良好。

4 轉染siBcl-2后A549/DDP對順鉑的敏感性 在A549/DDP細胞中轉染RNA后，siBcl-2組順鉑的IC50值為(4.83±0.76)μg/ml；NC組順鉑的IC50值為(11.47±1.02)μg/ml；敏感性提高了57.8%(P<0.05)(圖 8、9)。

圖 1 順鉑對A549細胞的抑制率 圖 2 順鉑對A549/DDP細胞的抑制率 圖 3 順鉑對A549及A549/DDP細胞的IC50值Fig 1 Cisplatin-inhibiting rate for A549 cells Fig 2 Cisplatin-inhibiting rate for A549/DDP cell Fig 3 IC50 value of cisplatin for A549 and A549/DDP cells

圖 4 Bcl-2 mRNA在A549及A549/ 圖 5 Bcl-2 蛋白在A549及A549/DDP 圖 6 轉染后A549/DDP細胞中Bcl-2 mRNA DDP細胞中的表達 細胞中的表達 的表達Fig 4 Expression of Bcl-2 mRNA in A549 and A549/DDP cells Fig 5 Expression of Bcl-2 protein in A549(1) and A549/DDP(2)cells 1: The protein level in A549 cells; 2: The protein level in A549/DDP cells Fig 6 Expression of Bcl-2 mRNA in A549/DDP cells after transfection NC: The Bcl-2 mRNA level in A549/DDP cells after transfection of negative control RNA; siBcl-2: The Bcl-2 mRNA level in A549/DDP cells after transfection of siBcl-2 RNA

圖 7 轉染后Bcl-2 蛋白在A549/DDP 圖 8 轉染后順鉑對A549/DDP細胞 圖 9 轉染后順鉑對A549/DDP細胞的IC50值細胞中的表達 的抑制率Fig 7 Expression of Bcl-2 protein in A549/DDP cells after transfection 1: The protein level in A549/DDP cells after transfetion of negative control RNA; 2: The protein level in A549/DDP cells after transfetion of siBcl-2 RNA Fig 8 Cisplatin-inhibiting rate for A549/DDP cells after transfection NC: The inhibition rate after transfection of negative control RNA; siBcl-2: The inhibition rate after transfection of siBcl-2 RNA Fig 9 IC50 value of cisplatin for A549/DDP cells after transfection NC: The IC50 value after transfection of negative control RNA; siBcl-2: The IC50 value after transfection of siBcl-2 RNA

討 論

肺癌耐藥的機制十分復雜，至今仍未完全闡明，有多種基因參與此過程，其中Bcl-2基因在腫瘤的發生發展中起重要作用[6]。Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，B細胞淋巴瘤/白血病)基因，是1984年Jsujimoto等在研究B細胞濾泡性淋巴瘤中分離出來的一種原癌基因。正常的Bcl-2基因定位于染色體18q1.3上，大小約230kb。該基因編碼26×103kDa大小的蛋白，位于線粒體膜、滑面內質網和核膜上。該基因能抑制諸如抗腫瘤藥等凋亡信號引起的細胞凋亡[7]。有數據顯示，Bcl-2基因的高表達導致多種腫瘤對化療藥物耐藥[8]。Bcl-2不阻止藥物進入細胞，不抑制藥物引起的DNA損傷，也不改變細胞對DNA的修復速率和細胞周期動力學，該基因導致耐藥的機制主要是通過抑制腫瘤細胞的凋亡途徑實現的[9]。

有報道，Bcl-2基因的高表達與子宮內膜癌等多種腫瘤對化療藥物的耐藥有關[10]。Bcl-2低表達的卵巢癌對化療反應良好[11]。戴明等[12]發現人肺腺癌細胞紫杉醇耐藥與Bcl-2高表達有關。但是也有報道稱Bcl-2的低表達與乳腺癌細胞MCF-7多西他賽耐藥有關[13]。

本研究中我們以人肺腺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP及其親本細胞A549為模型，發現A549/DDP中Bcl-2 mRNA表達的表達量為A549的3.77±0.56倍，其蛋白表達量也明顯升高。通過在A549/DDP細胞轉染Bcl2-siRNA，使Bcl-2 mRNA及蛋白在細胞中的表達明顯降低，從而使順鉑對A549/DDP細胞的半數抑制濃度IC50由(11.47±1.02)μg/ml下降到(4.83±0.76)μg/ml，大大提高A549/DDP細胞對順鉑的敏感性。說明Bcl-2基因的表達與肺癌耐藥關系密切，同時，本研究也證實了Bcl2-siRNA對于逆轉肺腺癌順鉑耐藥具有確切的作用，為肺癌耐藥這一難題的攻克提供理論依據。

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