大鼠肥厚心肌組織CaN Aβ基因沉默的實現及對細胞肥大抑制作用

齊迎春，謝曉華，陳 雯，李朝暉

解放軍總醫院 南樓綜合外一科，北京 100853

左室心肌肥厚(myocardial hypertrophy，LVH)是高血壓、心臟瓣膜病以及心肌缺血等常見的心臟疾患發生發展過程中共同的病理生理過程之一，是目前公認的心血管疾病發病及死亡的獨立危險因素[1]。鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)在病理性心肌肥厚發生發展中起重要作用[2-3]，抑制CaN通路為心肌肥厚的防治提供了一種全新的視角。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術作為一種新興的研究及治療手段，有巨大的潛在價值及重要的臨床診療意義。本研究采用RNAi技術，構建質粒非病毒載體進行轉染，以探討動物水平心肌組織提高非病毒載體轉染效率的方式及安全、有效抑制CaN通路的方法。

材料和方法

1 主要試劑 Block-it U6 RNAi Entry載體試劑盒(Invitrogen)，TOP10感受態大腸桿菌細胞，質粒大提試劑盒(威格拉斯)，膠原酶Ⅱ(Sigma)，透明質酸酶(Sigma)，聲諾維微泡(Sonovue，Bracco)，CaN Aβ多克隆抗體(Santa crutz)，RT-PCR系統(promega，A3500)，Trizol(Gibico)，PCR引物(賽百盛公司)。

2 動物與分組 160-200g Wistar成年雄性大鼠(n=30)(軍事醫學科學院動物中心)，隨機分為6組(每組5只)：1)假手術組：僅開腹，術后飲用正常水；2)“一腎一夾”模型組：術后26d處死。3)CaN Aβ心包腔內干擾組：“一腎一夾”術后第20天，經心包腔內途徑轉染siRNA表達質粒，轉染6d后處死。4)CaN Aβ舌下靜脈干擾組：“一腎一夾”術后第20天，經舌下靜脈途徑轉染，轉染6d后處死。5)心包腔內陰性對照組：以針對綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)特定序列的干擾質粒作為陰性對照干擾質粒，心包腔內注射轉染，轉染6d后處死。6)舌下靜脈陰性對照組：以針對GFP特定序列的陰性對照干擾質粒，舌下靜脈內注射轉染，轉染6d后處死。其中麻醉后未蘇醒2只。

3 “一腎一夾”高血壓心肌肥厚動物模型制作 術前12h禁食。戊巴比妥鈉麻醉后仰臥固定，開腹后暴露左腎腎蒂，分離腎動脈，在近腹主動脈端0.5cm處使用U型銀夾(內徑0.2mm)夾住，使腎動脈狹窄但血流未被完全阻斷。結扎右側腎動靜脈及右側輸尿管，切除右腎，關腹。術后以1%氯化鈉代飲水。

4 質粒制備 選取我們已在細胞水平上篩選的CaN Aβ基因的有效干擾片段1280(21bp)GCAAGAT GGCAAGAGTCTTCT，以針對GFP的GCTGACCCT

GAAGTTCATC(19bp)序列作為陰性對照[4]。根據Entry vector的特點設計單鏈寡核苷酸，退火處理合成雙鏈寡核苷酸，克隆至pENTRTM/U6載體中，轉化TOP10感受態大腸桿菌，培養皿過夜培養后挑取4個分離較好的單菌落，搖床過夜擴增(37℃，180r/min)。菌落PCR初步鑒定，并取少量菌液測序(三博遠志公司)，測序正確的菌種大量制備質粒，并經紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳測定質粒濃度及質量。

5 基因包載與檢測 用0.9%氯化鈉注射液稀釋2mg質粒至總體積5ml，注入sonovue微泡凍干粉瓶中，振搖混合成乳白色，即微泡+質粒混懸液。酶的配制：稱取透明質酸酶0.8mg，膠原酶Ⅱ1mg，溶于0.9%氯化鈉注射液250μl。心包腔內組取微泡+質粒混懸液500μl與酶溶液250μl混合(每只心包腔內注射液體總體積為750μl)。舌下靜脈組取微泡+質?；鞈乙?00μl(含質粒200μg，無酶)。微泡+質粒懸液及微泡+質粒+酶懸液各取50μl，另取僅加入0.9%氯化鈉注射液的sonovue微泡懸液50μl作空白對照，分別加入GelRed 0.5μl，GelRed可與DNA結合并在紫外光下激發熒光，使用熒光顯微鏡觀察質粒與微泡的黏附情況。鏡下可見(圖1)，sonovue微泡與質粒共同孵育后，微泡表面光暈較單純的sonovue微泡表面光暈增厚，表明sonovue表面結合了一定的質粒，加入酶溶液后，微泡的完整性以及質粒與微泡的黏附不會受到明顯影響。

6 經腹心包腔內注射方法 參照既往報道[5]的方法，戊巴比妥鈉麻醉后固定。消毒后取上腹部中線切口約2-3cm，暴露膈肌，取自制套管針，以心臟上緣與肺交界、靠近鐮狀韌帶處進針，水平向前刺入，有突破感后撤出針芯，將質粒微泡及酶的混合液750μl注入心包腔內，拔出套管針，以無菌紗布按壓針孔1-2min，關腹。

7 超聲導入 在心包腔內注射后30min-1h、舌下靜脈注射同時進行。使用Philips5500超聲儀、S3探頭，心前區去毛后涂藕合劑，將探頭垂直于心前區表面，照射參數為：二次諧波(頻率為1.3/2.6MHz)，機械指數MI 1.6，深度4cm，持續8min，心電觸發模式，每5個周期觸發1次。

8 檢測 下腔靜脈取血，采用日立7600全自動生化儀測定血漿常規肝腎功能、心肌酶指標：谷丙轉氨酶(GPT)/谷草轉氨酶(GOT)、肌酐(Cr)/尿素氮(UN)/尿酸(Ua)、肌酸激酶(CK)/心肌型肌酸激酶同功酶(CK-MB)/乳酸脫氫酶(LDH)。橫切面切取心室水平心肌組織50-80mg，提取總RNA，采用兩步法RT-PCR試劑盒，以β-actin為內參(ctatcggcaatgagcggttc，cttaggagttgggggtggct)，觀察CaNAβ(agggatgttgcctagtgg，gtatgtgcggtgttcagg)及肥大相關基因心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)(ctgctagaccacctggaga，accaagctgtgtgacacacc)以及β-重鏈肌球蛋白(myosin heavy chain，β-MHC)(cccagaacaccagcctcatc，ctcttcctcatgcccttcaccgac)基因的mRNA水平。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，采用Champ Gel 3000凝膠分析儀掃描，以目的片段與內參片段光密度之比作為mRNA的相對含量。切取左心室前壁臟層心包下少量薄層心肌組織50-80mg，方法同上進行相關基因的mRNA水平檢測。另取小塊左室前壁心肌組織立即置-70℃冰箱保存，以CaN Aβ多克隆抗體(濃度1∶100)作為一抗，冰凍切片后進行心肌免疫熒光檢測。

9 統計學分析 以-x±s表示計量資料，采用SPSS15.0軟件行方差齊性檢驗以及單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用LSD法進行組間兩兩比較，以α=0.05為檢驗水準。

結 果

1 心肌組織RT-PCR結果 橫切面切取心室水平心肌組織進行RT-PCR，結果表明“一腎一夾”模型組大鼠CaN mRNA水平及肥大相關基因ANF、β-MHC基因mRNA水平明顯高于假手術組(P<0.05)，但是“一腎一夾”模型組(0.43±0.09)、CaN Aβ心包腔內組(0.36±0.10)、CaN Aβ舌下靜脈組(0.39±0.11)、心包腔內陰性對照組(0.41±0.05)及舌下靜脈陰性對照組(0.43±0.14)之間比較，心肌組織 CaN Aβ、ANF、β-MHC mRNA水平比較無統計學差異(P>0.05)。切取左心室前壁臟層心包下薄層心肌組織進行相關基因的RT-PCR，結果表明心包腔內干擾組大鼠與模型組及心包腔內陰性對照 組 相 比，CaNAβmRNA水 平 及ANF、β-MHC基因mRNA均有明顯降低(P<0.05)。見表1。

2 血漿常見肝腎功能、心肌酶水平 各組之間心肌酶(CK/CK-MB/LDH)、肝功能(GPT/GOT)比較無統計學差異(P>0.05)，所有“一腎一夾”手術組血漿Cr水平較假手術組均有明顯增加(P<0.05)，BUN及Ua各組之間無統計學差異(P>0.05)。

3 心肌組織CaN Aβ蛋白免疫熒光染色 心肌組織CaN Aβ蛋白免疫熒光染色后，CaN Aβ顯示為胞漿內紅色熒光，心肌細胞核顯示為藍色熒光?？梢娕c“一腎一夾”模型組比較，CaN Aβ干擾心包腔內組大鼠心外膜下部分心肌細胞胞漿紅色熒光明顯減弱，說明細胞內CaN Aβ蛋白含量相對較低。CaN Aβ干擾舌下靜脈注射組和各陰性對照組均無明顯減弱。見圖2。

表1 CaN Aβ、ANF、β-MHC基因mRNA 水平(心外膜下薄層心肌組織)Tab 1 Levels of CaN Aβ, ANF and β-MHC mRNA in myocardial tissue(-x±s)

討 論

心肌肥厚是高血壓、心臟瓣膜病、心肌缺血等常見心臟疾患的共同病理生理過程之一，與心血管病發病及死亡風險間存在明顯正相關[6]。CaN在病理性心肌肥厚發生發展中起重要作用，多種因素如內皮素、醛固酮、血管緊張素等均可上調大鼠心肌細胞CaNAβ的轉錄，介導心肌肥大的信號通路[7]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術是通過轉錄后基因沉默的方式來抑制目標蛋白的表達，是誘導基因沉默、研究基因功能的重要手段。但安全、高效、高特異性的轉染載體及轉染方式一直是其臨床應用的瓶頸，也是各國學者研究的熱點。可以通過非病毒載體或病毒載體的方式構建，病毒載體轉染效率高，但制備復雜，有一定的免疫原性，不適于體內重復使用，而且病毒的基因產物對細胞可能產生一定的毒性，同時還有整合突變、重組成能夠復制的病毒等風險；非病毒載體相對更為經濟、操作簡便、易構建、低毒性、無免疫原性、無傳染性，適于臨床重復應用[8]，但非病毒載體的轉染效率遠不如病毒載體，若能改善非病毒載體的轉染效率，它將更具有臨床應用價值。本研究采用RNAi理論及技術，選擇質粒非病毒載體，關鍵問題就是如何改善非病毒載體的轉染效率，獲得安全有效的目的基因(CaNAβ)的沉默，從而達到抑制心肌肥大的目的。

我們制作大鼠心肌肥厚模型，針對CaN Aβ既往驗證的siRNA有效序列-1280(21bp)構建小發夾RNA (short hairpin RNA，shRNA)表達載體(si1280)，采用心包腔內及舌下靜脈內注射輔以超聲導入的方法，在整體動物水平轉染心肌組織，通過CaN Aβ基因mRNA水平及其蛋白表達的情況體現肥厚心肌組織CaN Aβ的抑制效果，并關注肥大相關基因ANF、β-MHC mRNA水平的變化。研究表明，“一腎一夾”模型組大鼠較假手術組CaNAβ基 因mRNA水 平 及ANF、β-MHC基因mRNA水平均明顯升高；切取左心室前壁臟層心包下薄層心肌組織檢測，心包腔內干擾組大鼠與模型組及心包腔內陰性對照組相比，CaN Aβ、ANF、β-MHC基因mRNA水平均有明顯降低；若以橫切面切取心室心肌組織，心包腔內干擾組的CaN AβmRNA水平低于其他手術組，但上述基因mRNA水平在各手術組之間比較均無統計學差異，這可能與樣本量相對有限、有效的轉染較集中于心外膜下心肌組織等因素有關。免疫熒光檢測結果也提示，CaN Aβ干擾心包腔內組大鼠心外膜下局部心肌細胞胞漿CaN Aβ蛋白含量下降，而CaN Aβ干擾舌下靜脈注射組和各陰性對照組CaN Aβ蛋白含量無明顯減少。

圖1 質粒與聲諾維(sonovue)結合情況的檢測A：sonovue微泡；B：微泡+質粒；C：微泡+質粒+酶Fig 1 Binding of plasmid to sonovueA：Sonovue bubbles; B: Sonovue+plasmid; C: Sonovue+plasmid+enzyme

圖2 心肌組織CaN Aβ蛋白免疫熒光染色(×20)A：“一腎一夾”模型組；B：心包腔內干擾組；C：舌下靜脈干擾組Fig 2 Immunofluorescence staining of CaN Aβ protein in myocardial tissue(×20)A: Hypertrophic model group; B: Intrapericardial RNAi group; C: Sublingual vein RNAi group

心包腔作為一個密閉腔，可充分延長心肌組織與載體的接觸時間，有利于目的基因在心肌組織的表達，并具有一定靶向性。本研究所采用的聲學造影劑微泡、超聲導入以及酶類的應用，對減輕心包臟層對轉染的屏障作用、增加質粒的轉染效率起到了一定的輔助作用。其中，超聲微泡導入增強轉染效率的方式越來越受到國內外學者的重視[9-10]，其原理主要是攜帶基因的聲學微泡在超聲作用下瞬間破裂，同時產生聲孔效應，有助于載體更易到達組織[8]，此傳輸系統操作簡單、損傷較小而且有一定靶向性，最主要的是可提高轉染效率，彌補質粒等非病毒載體轉染效率相對低下的不足。我們的研究同時表明，各組血漿常見肝酶、心肌酶含量無顯著差異，“一腎一夾”各手術組之間血漿Cr含量無顯著差異，提示經舌下靜脈和心包腔內途徑輔以超聲微泡導入的方式對心、肺、肝及腎等組織無明顯損傷，使其在臨床上的進一步應用成為了可能。我們試驗所涉及的質粒用量有待進一步考究，以及超聲各個參數的優化還需更為深入的研究，以獲得更為滿意的轉染效果。如能進一步改善質粒轉染效率(如輔以酶類)、增加心肌的靶向性(如使用心肌特異性啟動子)、這種方法將會具有更大的臨床應用潛力。

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