小鼠骨髓間充質干細胞移植后在炎癥性腸病模型的定位

陳倩倩，萬 軍，閻 麗，王衛(wèi)華，王昌正，石 卉，蘇斌斌，曾慶環(huán)，杜海濤

解放軍總醫(yī)院 南樓消化科，北京 100853

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)，是一種病因和發(fā)病機制尚未完全明了的慢性腸道炎性疾病，近年來其發(fā)病呈上升趨勢。目前的治療手段包括抗炎藥物、激素、免疫抑制劑及生物治療等，但療效不佳。國外有報道[1]稱造血干細胞移植治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤合并IBD的案例，移植后其IBD癥狀也隨之得到緩解，這為IBD的治療提供了一種新的選擇。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有自我更新、多向分化功能，在特定條件下可誘導成為骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞等，還可向神經(jīng)細胞、心肌細胞、上皮細胞、血管內皮細胞分化[2]。本實驗以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)作為灌腸劑，構建小鼠炎癥性腸病模型，以小鼠的BMSCs為細胞源，經(jīng)尾靜脈途徑進行移植，并觀察其在腸道損傷部位的定植情況。

材料和方法

1 實驗動物 BALB/C小鼠，6-8周齡，雌性，SPF級，用于制作IBD動物模型；BALB/C小鼠，2-3周齡，雄性，SPF級，用于提取骨髓間充質干細胞；均由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

2 主要實驗試劑及儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸(Sigma公司)；低糖改良Eagle完全培養(yǎng)基(Hyclone公司)；0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(Gibco公司)；頂級胎牛血清(Gibco公司)；油紅-O(Sigma公司)；茜素紅S(Sigma公司)；CFDA SE(上海奔大生物科技有限公司)；DNA提取試劑盒(Omega公司)；倒置相差熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；PCR儀(Eppendorf公司)。

3 小鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)[3]用斷頸法處死小鼠，乙醇浸泡鼠體2min，在超凈臺中取出四肢骨并將其附著肌肉組織剝離干凈，低糖改良Eagle完全培養(yǎng)基(LG-DMEM)浸泡。用1ml注射器分別在骨兩端鉆一小孔，用LG-DMEM反復沖洗骨髓腔至四肢骨干呈略帶透明狀，取出四肢骨用手術剪將其剪成1-3mm3的骨片后，將其移入5ml小瓶中并加入3ml LG-DMEM(含雙抗)及1mg/ml(wt/vol)膠原酶Ⅱ，置于37℃恒溫搖床上以200r/min速度搖1-2h后中止消化，并洗滌3次后加入6ml含10%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM置于37℃，5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。靜置3d后首次換液，并除去未貼壁的細胞及骨組織。原代培養(yǎng)第5天進行傳代，加入1ml 0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA，細胞培養(yǎng)箱中消化1min，以1∶2進行傳代。此后每2d換1次液，待細胞生長滿培養(yǎng)皿的80%-90%可進行傳代。

4 小鼠骨髓MSCs的標記 取第3代BMSCs進行熒光標記，用1ml CFDA SE細胞標記液懸浮2×106/細胞，加入1ml CFDA SE儲存液(2×)，37℃孵育10min后加入完全細胞培養(yǎng)液(含血清)終止，PBS洗滌2次后，用2ml PBS重懸細胞，備用；經(jīng)過標記的細胞可按正常方法進行培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下直接觀察標記效果。

5 IBD模型構建及分組 參考文獻[4]方法加以改進：將小鼠隨機分為3組：對照組(n=12)：給予0.9%氯化鈉溶液100μl灌腸后第2天給予尾靜脈移植BMSCs；TNBS組(n=12)：給予TNBS 2.0mg/50%乙醇灌腸劑 100μl；TNBS-MSCs移植組(n=12)：給予TNBS 2.0mg/50%乙醇灌腸劑100μl，并于造模后第2天給予尾靜脈移植BMSCs。小鼠禁食不禁飲，48h后稱重。用左手固定小鼠，右手將2.5cm靜脈留置針經(jīng)小鼠肛門輕輕插入結腸，至套管頂端距離肛門約2.5cm，立即將連有1ml注射器的套管針內芯插入套管，使小鼠倒立，分別緩緩注入TNBS 2.0mg/50%乙醇灌腸劑100μl，拔出套管針，使小鼠保持倒立姿態(tài)60s后放入籠中，對照組給予0.9%氯化鈉溶液。此后每隔1d測量小鼠體重變化情況。

6 細胞移植及取材 造模后第1天，TNBS-MSCs移植組小鼠均經(jīng)尾靜脈注射0.1ml CFDA SE標記的BMSCs懸液(含有1×106細胞)。于移植后第2、5、9天各處死4只，取遠端結腸組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗腸道內容物，觀察腸道大體形態(tài)變化。一部分制成冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察腸道熒光定植情況，及進行HE染色觀察腸道病理變化；另一部分用于提取DNA進行SRY基因檢測。

7 聚合酶鏈式反應 分別提取移植后第9天的TNBS組、TNBS-MSCs移植組及用于提取干細胞的雄性小鼠結腸組織DNA后，采用PCR技術檢測Y染色體的性別決定區(qū)(SRY)基因，觀察BMSCs在受體結腸組織的植入情況。引物由primer3軟件設計，由上海生工生物工程公司合成，上游引物序列為5'-GGTGTGGTCCCGTGGTGAGAG-3'，下游引物序列為5'-ATGGCATGTGGGTTCCTGTCC-3'，所得產(chǎn)物片斷為294bp。反應體系為25μl，擴增條件：94℃ /2min，35×(94℃ /20s，64℃ /20s，72℃ /20s)，72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，于Image Master VDS凝膠掃描儀上成像。

8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計學分析軟件。多組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)t檢驗比較分析。

結 果

1 BMSCs形態(tài)學特點 原代培養(yǎng)可見貼壁細胞從骨片中爬出來，形態(tài)為小圓形、多角形、梭形、扁平形，增殖形成大小不等的克隆集落，并向周圍進一步擴展變大與鄰近的克隆集落融合，經(jīng)換液傳代后細胞形態(tài)較為一致，融合狀態(tài)時細胞排列呈束狀、旋渦狀或放射狀，見圖1A；用CFDA SE熒光標記后幾乎所有BMSCs呈綠色熒光，見圖1B。2 IBD模型一般情況 TNBS組及TNBS-MSCs移植組的BALB/C小鼠造模24h后出現(xiàn)懶動、身體蜷縮、扎堆、厭食、大便次數(shù)增多、多為稀便或血便、體重下降等情況，TNBS組小鼠此后3d上述癥狀不同程度加重，其中體重在第3天下降最為明顯，造模后第5天，上述癥狀逐漸改善。對照組小鼠則反應靈活、食量正常、體重增加。TNBS-MSCs移植組小鼠于造模24h后給予尾靜脈移植BMSCs，并與移植后第2天體重開始上升，上述癥狀較前明顯好轉直至恢復正常。各組小鼠體重變化見圖3。3 IBD模型病理 造模后第3天，遠端結腸腸壁大部分結構破壞，明顯充血、水腫、伴有點狀或片狀出血，多發(fā)潰瘍形成，糜爛、壞死，多呈節(jié)段性，部分腸管狹窄(圖2A)；光鏡下為腸黏膜充血水腫、上皮脫落、潰瘍、糜爛、壞死、出血，部分潰瘍深達黏膜全層，黏膜下層有大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤(圖2C)。正常對照組腸壁表面光滑，結構完整(圖2B)；光鏡下可見腸道黏膜完整、無破壞，腸腺開口清晰，腺管表面界溝明顯，可見杯狀細胞和吸收細胞，無炎癥細胞浸潤(圖2D)。

4 CFDA SE標記的BMSCs移植后在腸道的分布TNBS-MSCs移植組綠色熒光標記的BMSCs較多分布在腸道潰瘍壞死病灶周邊(圖3)，而對照組無潰瘍壞死的正常腸道黏膜無BMSCs定植。

5 SRY基因在各組小鼠腸道內的檢測 在移植后的第9天TNBS-MSCs移植組及雄性小鼠對照組均能檢測到SRY基因，在TNBS組不能檢測到該基因，見圖4。

討 論

近年來，隨著干細胞研究的深入，MSCs移植已被用來治療心血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病及自身免疫性疾病等[5-7]，并取得了一定的治療效果。本實驗采用骨片培養(yǎng)法獲得生長迅速、純度較高、生物活性好的BMSCs，采用成脂肪、成骨誘導分化的方法來鑒定BMSCs的多向分化能力，從而證明該細胞為骨髓中的多能干細胞；而且也表明經(jīng)過體外傳代后BMSC仍然保持其多向分化的能力。目前炎癥性腸病的動物模型很多，本實驗采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)復制出類似人發(fā)病的模型，該模型具有操作簡便、經(jīng)濟實用、重復性好、造型時間短等優(yōu)點。病理學改變也與人發(fā)病相似，發(fā)病時可見結腸黏膜毛細血管擴張、充血、水腫，大量的中性白細胞、淋巴細胞及單核細胞浸潤，并可見點狀或片狀出血點。黏膜腺體正常結構破壞，腺細胞減少或消失，有隱窩膿腫及潰瘍形成。

BMSCs還具有向骨髓歸巢及損傷部位遷移的特性[8]，植入細胞在受體內的歸巢，對于鑒定細胞移植是否成功至關重要。經(jīng)尾靜脈移植的BMSCs經(jīng)血液循環(huán)到達腸道損傷部位的機制可能是，BMSCs的黏附分子可在全身神經(jīng)-體液免疫系統(tǒng)調控下表達逐漸增強，并在受損傷部位炎癥介質的引導下向損傷結腸部位附壁、游出、趨化，穿過血管內皮屏障后定植于該部位并逐漸增多，為其促進潰瘍部位再生修復奠定了基礎。但不是所有移植BMSCs都聚集于損傷結腸，其余細胞在趨化因子的作用下逐漸歸巢于骨髓，結腸以外器官內干細胞逐漸減少。有研究顯示，BMSCs主要分布于腸道組織的黏膜層中[9]。本實驗通過熒光顯微鏡觀察到CFDA SE標記的BMSCs可以定植到腸道上皮細胞層或腸黏膜隱窩的結腸上皮祖細胞定居的部位，多數(shù)位于BMSCs多分布于黏膜潰瘍和糜爛處病灶周邊，而正常組織黏膜層、未移植組及重度損傷區(qū)域未見BMSCs定植。有實驗[10]選擇雌性IBD模型小鼠為移植受體，以雄性小鼠的BMSCs為細胞源，選擇雄性基因SRY為分子標志，采用PCR技術檢測植入細胞在動物體內的歸巢，結果顯示在移植后第9天可檢測到SRY陽性細胞存在，而其相應對照組則無信號顯示；但并不是在所有TNBS-MSCs移植組的結腸黏膜中能檢測到熒光或SRY基因表達，這可能與細胞增殖數(shù)量、細胞歸巢時間、取材及IBD模型組織損傷的輕重程度有關。可見移植的BMSC可在受體內存活并進入局部組織微環(huán)境，但一方面存在BMSCs被血液稀釋可能最終進入結腸組織的細胞數(shù)量有限；另一方面，經(jīng)外周移植的BMSCs不僅僅只在結腸分布，在經(jīng)過肺、肝等臟器時發(fā)生滯留。

表1 各組小鼠體質量變化率Tab1 Weight of mice in different groups(-x±s)

圖1 BMSCs的培養(yǎng)及熒光標記A：未標記干細胞；B:熒光標記干細胞Fig 1 Incubation and flourescent labelingA: Unlabeled MSCs; B: fluorescent labeled MSCs

圖2 腸道組織肉眼觀及HE染色A：IBD模型組腸道黏膜肉眼觀；B：對照組腸道黏膜肉眼觀；C：IBD模型腸道組織HE染色；D：對照組腸道組織HE染色Fig 2 HE staining of colon tissueA: Macroscopic observation of colon mucosa in IBD model group; B：Macroscopic observation of colon mucosa in control group; C: HE staining of colon tissue from IBD model group; D: HE staining of colon tissue from control group

圖3 移植后腸道內BMSCs圖4 Y染色體PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig 3 BMSCs in colon after transplantationFig 4 Agarose gel electrophoresis of PCR Y chromosome products

綜上所述，BMSCs可作為細胞移植治療炎癥性腸病的一種細胞源選擇。然而，有關BMSCs如何發(fā)揮作用、是否可以在受體腸道組織內長期存活并增殖分裂、是否定向分化為腸道干細胞、是否通過免疫及炎癥調節(jié)機制促進腸道本身的干細胞定向分化、是否對IBD各個發(fā)病階段或其并發(fā)癥都發(fā)揮作用、以及植入后干細胞在體內的最終命運等等問題，還需要研究人員進一步深入探討。

1 Ditschkowski M， Einsele H， Schwerdtfeger R， et al. Improvement of inflammatory bowel disease after allogeneic stem-cell transplantation［J］. Transplantation，2003，75（10）：1745-1747.

2 Bianco P，Robey PG，Simmons PJ. Mesenchymal stem cells：revisiting history，concepts，and assays［J］. Cell Stem Cell，2008，2（4）：313-319.

3 Zhu H，Guo ZK，Jiang XX，et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone［J］.Nat Protoc，2010，5（3）：550-560.

4 Daniel C， Sartory NA， Zahn N， et al. Immune modulatory treatment of trinitrobenzene sulfonic acid colitis with calcitriol is associated with a change of a T helper （Th） 1/Th17 to a Th2 and regulatory T cell profile［J］. J Pharmacol Exp Ther，2008，324（1）：23-33.

5 Assmus B， Rolf A， Erbs S， et al. Clinical outcome 2 years after intracoronary administration of bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction［J］. Circ Heart Fail，2010，3（1）：89-96.

6 Quante M，Wang TC. Stem cells in gastroenterology and hepatology［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2009，6（12）：724-737.

7 Sun L，Akiyama K，Zhang H，et al. Mesenchymal stem cell transplantation reverses multiorgan dysfunction in systemic lupus erythematosus mice and humans［J］. Stem Cells，2009，27（6）：1421-1432.

8 Barry FP， Murphy JM. Mesenchymal stem cells： clinical applications and biological characterization［J］. Int J Biochem Cell Biol，2004，36（4）：568-584.

9 Tanaka F，Tominaga K，Ochi M，et al. Exogenous administration of mesenchymal stem cells ameliorates dextran sulfate sodium-induced colitis via anti-inflammatory action in damaged tissue in rats［J］.Life Sci，2008，83（23-24）：771-779.

10 劉芳，陳少紅，劉青波，等.骨髓間充質干細胞移植后的肝功能重建［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（10）：1803-1808.