苯甲酸雌二醇對慢性腦缺血大鼠海馬膽堿乙酰轉移酶變化及雌激素的影響

張燕平

河南中醫學院第一附屬醫院神經內科 鄭州 450000

慢性腦缺血或腦灌注不足伴發于腦動脈粥樣硬化、血管性癡呆、Alzheimer病、Binswanger病等多種腦血管疾病的病理過程中，發病早期以認知功能損害為主要表現，最終可能導致持久或進展性認知與神經功能障礙［1］。有學者認為，腦內膽堿能系統功能障礙是慢性腦缺血患者記憶障礙和其他認知功能障礙的原因之一［2］。而膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，CHAT）是 決 定 乙 酰 膽 堿 （acetylcholine，Ach）含量的關鍵因素，有關其在慢性腦缺血中的作用目前報道甚少。海馬CA1區是參與學習和記憶形成的重要部位，加之此區由于對稱性突觸多于γ－氨基丁酸（gama aminobutyric acid，GABA）突觸［3］。因此，腦組織遭受缺血后此區的神經元更易損傷。有鑒于此，本研究在建立慢性腦缺血模型并應用雌二醇進行治療的基礎上觀測其行為學和海馬CHAT陽性神經元的變化，進一步推測該藥對慢性腦缺血大鼠可能的神經保護機制。

1 材料與方法

1.1材料健康SD大鼠，雄性，體質量300～400g，由河南省實驗動物中心提供。苯甲酸雌二醇、滅菌油溶液為上海通用藥業制藥廠產品；CHAT試劑盒為北京中杉公司產品。

1.2方法

1.2.1 動物模型的建立：30只大鼠隨機分為假手術組、缺血組和治療組，每組各10只。制作慢性腦缺血模型：10%水合氯醛（0.3mL／100g）腹腔注射麻醉，頸部備皮并消毒后，頸正中切開皮膚，鈍性分離雙側頸總動脈，結扎雙側頸總動脈的遠心端與近心端后，從中間剪斷；假手術組除不結扎雙側頸總動脈外，其余過程與手術組相同。

1.2.2 實驗動物的處理：術后當天給藥，治療組給予苯甲酸雌二醇腹腔內注射（1mg／kg），每周2次；假手術組、缺血組給予苯甲酸雌二醇溶媒類似物——煮沸過的麻油。所有大鼠于術后飼養60d。

1.2.3 大鼠學習記憶能力測試：術后60d采用Y型電迷宮法進行主動逃避學習能力測試［9］，大鼠認知能力以達到連續10次測試中有9次（9／10）正確反應時所需的電擊次數表示。術前及術后預測試1次，刪除靈活性過差的大鼠。

1.2.4 免疫組化染色：學習記憶能力測試后，大鼠麻醉，打開胸腔，暴露心臟，用250mL生理鹽水（37℃）經心臟灌注快速沖洗去除血細胞，再用4%多聚甲醛250mL灌注固定，快速取腦，經4%多聚甲醛固定24h，石蠟包埋后切片，片厚約4μm，免疫組化采用SP法。主要步驟為：①3%H2O2室溫孵育10min；②10%正常山羊血清封閉室溫孵育15min；③滴加一抗（CHAT，1：50）4℃ 過夜；④ 滴加生物素標記的二抗（1：100）37℃ 孵育30min；⑤ 滴加辣根過氧化物酶標記的卵白素（1：100）37℃ 孵育30min；⑥DAB顯色；⑦PBS終止反應。脫水，透明，封片，光鏡下觀察。空白對照實驗用PBS代替CHAT一抗。

1.2.5 CHAT的測定：于400倍光學顯微鏡下觀察CHAT免疫組織化學陽性物質的分布，同時采用德國Leica公司圖像分析系統，測定海馬區陽性物質的光密度值（OD值），每張切片隨機選取10個不連續視野，取其平均值，所有OD值測量均在相同的光學條件下完成。

1.2.6 統計學處理：采用SPSS 10.0統計軟件處理數據，所有結果均采用均數±標準差（s）表示，用方差分析及兩樣本均數比較的t檢驗對數據進行分析，檢驗水準：α＝0.05。

2 結果

2.1認知能力測試結果見表1。缺血組和治療組學會主動逃避所需的電擊次數較假手術組明顯增多（P＜0.01），表明認知能力下降。治療組較缺血組認知能力改善明顯（P＜0.01）。

2.2 CHAT免疫組化結果對照組海馬均有大量CHAT陽性神經元和纖維分布。缺血組CHAT陽性神經元和纖維顯著減少，分布稀疏，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。雌二醇治療組CHAT陽性神經元和纖維明顯增多，與缺血組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表1 術后60d3組大鼠認知能力測試結果 （s）

表1 術后60d3組大鼠認知能力測試結果 （s）

與假手術組相比，＊P＜0.01；與缺血組比較，＊＊P＜0.01

組別 n 達到學會標準所需電擊次數假手術組10 34.50±7.29缺血組 10 81.67±11.02＊治療組 10 59.33±11.33＊＊

表2 CHAT在各組鼠的表達 （s）

表2 CHAT在各組鼠的表達 （s）

與假手術組相比，＊P＜0.01；與缺血組比較，＊＊P＜0.01

組別 n 海馬CA1區假手術組10 76.3710±6.5142缺血組 10 48.2500±3.3126﹡治療組 10 75.7000±3.2111＊＊

3 討論

基底前腦富含膽堿能神經元，該類神經元發出投射纖維至皮質、海馬，并在皮質興奮、注意力集中及學習記憶中起重要作用。膽堿能系統在學習記憶中作用逐步得到公認。已有證據表明，海馬結構是參與學習和記憶功能的重要部位，且與膽堿能系統直接相關［4］。同時，海馬也是大腦具有可塑性和極易受損的一個腦區，對缺血缺氧極為敏感。本實驗采用持久性雙側頸總動脈結扎法造成大鼠腦組織缺血，經行為學測試存在學習記憶障礙，是較理想的慢性腦缺血模型。

CHAT是中樞神經系統合成Ach過程中重要的酶，它在膽堿能神經元胞體內合成，是膽堿能神經元的特殊標志，故?？梢宰鳛檠芯磕憠A能神經元的標志或估計Ach含量的間接指標［5］。本實驗結果發現慢性腦缺血大鼠海馬CA1區CHAT的活性明顯下降，同時出現行為學上的認知障礙，說明膽堿能系統在學習記憶中具有重要作用，而且說明海馬CHAT的表達下降參與了慢性腦缺血的發生。

有證據表明雌激素水平低下，可直接影響神經元的活性及修復，特別是在海馬、基底節、基底前腦和杏仁核，膽堿能神經元減少，突觸數目降低，雌激素缺乏可加速神經元缺失，影響軸突和樹突形成，同時影響多種神經遞質如Ach、5－HT、NE及NGF等，干擾正常的遞質代謝和信息傳遞，也就是說雌激素可以影響膽堿能系統和海馬，影響認知功能。雌激素可能通過與NGF、BDNF及其受體的相互調節對膽堿能神經元起營養支持作用［6］。本實驗發現，給予雌激素治療后，CHAT活性明顯升高，大鼠認知功能明顯改善，提示雌激素可能通過增加CHAT的活性來提高Ach含量，從而對記憶功能的維持起一定作用。另有研究發現，雌激素在體給藥后，腦皮層厚度和海馬CA1區突觸數增加，并能促進突觸體谷氨酸的釋放，促進培養的皮層膽堿能神經元發育，增強膽堿乙酰轉移酶活性和蛋白質含量，有利于Ach合成和易化突觸結構的可塑性。其中雌激素同時增強膽堿能和谷氨酸能神經元的活性可能是提高智能的關鍵［7］。Gibbs［8］認為雌激素可能調節神經營養因子的表達，改善膽堿能神經元CHAT活性。我們的試驗結果與上述報道相符，推測雌激素有可能通過直接的或對神經營養因子調節的間接作用，改善膽堿能神經元的營養狀況，增強CHAT的活性。

綜上所述，雌激素通過其多靶點的藥理機制，提高了海馬神經元CHAT的活性，改善了慢性腦缺血大鼠海馬神經細胞的膽堿能系統功能障礙，進而提高了大鼠的學習、記憶成績。

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［6］Gibbs RB，Wu DH，Hersh L，et al.Effects of estrogen replacement on the relative levels of choline acetyltransferase，trkA，and nerve growth factor messenger RNAS in the basal forebrain and hippocampal formation of adult rats［J］.Experimental Neurology，1994，129：70－80.

［7］Farr SA，Banks WA，Morley JE.Estradiol potentiaes acetylcholine and glutamate－mediated post－trial memory processing in the hippocampus［J］.Brain Res，2000，864（2）：263－269.

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［9］趙崇侃，程光，陳起勝 .一種智能化的Y型迷宮［J］.中國應用生理學雜志，1997，13：363