不同膳食脂肪酸構成對大鼠肝臟脂代謝相關基因表達的影響＊

時皎皎，糜漫天，韋 娜，王 斌，易 龍，張乾勇△

（1.成都軍區總醫院營養科，成都 610083；2.第三軍醫大學營養與食品安全研究中心／重慶市營養與食品安全重點實驗室，重慶 400038）

隨著經濟的發展和人們生活方式的改變，心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）已成為危害人類健康的主要疾病［1］，而脂質代謝紊亂引起的動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是CVD的重要誘因［2－3］。有研究發現，不同種類的膳食脂肪酸對血脂的變化存在不同程度的影響，而在相同膳食脂類攝入量下各種脂肪酸的構成比不同也會對血脂調節以及CVD等慢性病的發生、發展產生不同的效應。本研究前期觀察到在總脂肪含量為15%（wt／wt）的膳食干預下，與對照組比較，飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）的攝入有顯著升高血脂的作用，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）則對血脂有顯著降低的作用，而1∶1n－6／n－3組的降血脂作用更加顯著且全面［4］。由于在機體脂質代謝的調節過程中，FAS、PPARα等在脂肪酸和膽固醇的合成與代謝、膽固醇轉運、載脂蛋白水平等諸多方面都有重要的調控作用［5－6］。有研究也證明，不同種類的脂肪對這些脂代謝關鍵基因表達存在調節作用［7－8］。現將本研究不同膳食脂肪酸對大鼠肝臟組織中脂質代謝關鍵基因FAS、PPARα的mRNA表達的影響報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型與分組 選擇清潔級雌性Sprague－Dawley大鼠（45d齡）48只，體質量140～170g（購自第三軍醫大學野戰外科研究所實驗動物中心），適應性喂養3d后，按照隨機分組設計方法分為6組各8只，即SFA組、MUFA組、n－6PUFA組、n－3PUFA組、1∶1n－6／n－3組和對照組。持續喂養18周。將大鼠置于（22±2）℃、50%濕度及正常晝夜節律的環境中分籠飼養，自由飲水。

1.2 試劑 n－6PUFA由四川嘉里糧油工業公司的“金龍魚”牌葵花籽油（主要含亞油酸）提供；n－3PUFA采用山東鴻祥神生物公司的魚油（主要含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸）；MUFA由北京神州油橄欖技術開發公司生產的特級初榨橄欖油（主要含油酸）提供；SFA由自煉豬油提供。上述油脂經氣相色譜法分析其脂肪酸構成。Trizol分離試劑購自Invitrogen公司，RNA酶抑制劑、dNTP、Olig－（dT）18購于上海生工生物工程技術有限公司，M－MuLV逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶購于Promega公司，溴化乙啶購于Sigma公司，PCR marker購于北京天為時代科技公司。

1.3 肝臟組織總RNA的提取 實驗結束時，活殺大鼠，取肝臟組織0.1g，制備組織勻漿，利用Trizol試劑常規提取總RNA。每個樣品取1μL，ddH2O稀釋200倍后用核酸蛋白定量儀測定RNA含量與純度。整個過程所有使用的器械及液體均經0.1%焦礦酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）水處理，戴消毒手套操作，防止RNA酶污染。

1.4 逆轉錄－聚合酶鏈反應（reverse transcription，RT－PCR）檢測FAS和PPARαmRNA表達水平 取上述提取的總RNA 3 μg，65℃水浴5min和0℃冰浴5min后，依次加入RNA酶抑制劑20U、10mmol／L dNTP 2μL、Oligo（dT）18 1μg、5×反應緩沖液4μL、M－MuLV逆轉錄酶200U，加Erasol處理的去離子水至20μL，37℃孵育1h，再于70℃放置10min終止反應。取逆轉錄產物1.5μL進行PCR反應。引物序列根據基因率（Genebank）設計，由上海生工生物工程技術有限公司合成，引物序列、退火溫度及產物長度見表1。擴增的反應參數為95℃預變性5min，94℃變性45s，60℃退火、45s，72℃延伸1min，共30個循環，72℃延長10min。反應結束后，各取5 μL PCR擴增產物，以含0.5μg／mL溴化乙啶的1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，Bio－Rad成像分析儀觀察并照像。PCR的特異條帶以相對吸光度（intensity）×面積（mm2）表示，用各組校正吸光度與β－actin校正吸光度的比值表示其表達強弱。

1.5 統計學處理 應用SPSS11.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以±s表示，實驗結果進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同膳食脂肪酸構成對FAS基因表達的影響 與對照組比較，SFA組大鼠肝臟組織FAS mRNA表達顯著升高（P＜0.05），MUFA組、n－6PUFA組、n－3PUFA 組和1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織FAS mRNA表達顯著降低（P＜0.05），見圖1～2。

圖1 不同脂肪酸構成比喂飼對各組大鼠肝臟組織FAS mRNA表達的影響

2.2 不同膳食脂肪酸構成對PPARα基因表達的影響 與對照組比較，SFA組和 MUFA組大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達均無明顯變化（P＞0.05）。n－6PUFA組、n－3PUFA組和1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織PPARαmRNA 表達顯著升高（P＜0.05）。同時，與n－6PUFA組比較，n－3PUFA組和1∶1 n－6／n－3組大鼠肝臟組織 PPARαmRNA 表達顯著增加（P＜0.05），見圖3～4。

圖2 各組大鼠肝臟組織FAS mRNA表達電泳結果的灰度值分析

圖3 不同脂肪酸構成比喂飼對各組大鼠肝臟組織PPARα mRNA表達的影響

圖4 各組大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達電泳結果的灰度值分析

3 討 論

FAS是脂肪酸合成的限速酶，主要存在于肝臟、脂肪等組織中，在體內起催化丙二酸單酰CoA連續結合成長鏈脂肪酸的反應，其活性高低將直接控制著體內脂肪合成的強弱，從而對機體的脂質代謝調節起著重要的作用。有研究發現，PUFA對FAS基因的表達具有較強的抑制作用。Clarke等［9］研究結果表明，n－6PUFA和n－3PUFA使肝臟中的FAS mRNA表達降低了75%～90%，而SFA和MUFA對FAS mRNA的表達則無顯著的抑制作用。此外，成廷水［10］研究發現，SFA對FAS酶的活性影響不大，而不飽和脂肪酸對動物FAS的活性具有較明顯的抑制作用，這種抑制作用與不飽和脂肪酸的含量、不飽和程度、鏈的長短、雙鍵位置等多種因素有關。

本研究觀察到SFA組大鼠肝臟組織FAS mRNA的表達顯著升高（P＜0.05），而 MUFA 組、n－6PUFA 組、n－3PUFA組、1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織的FAS mRNA 表達均顯著降低（P＜0.05）。這表明在同脂肪含量的情況下，n－3PUFA與n－6PUFA抑制FAS表達方面的功能要強于SFA和MUFA，與文獻［9］報道基本一致。本研究發現，SFA干預能導致大鼠肝臟組織FAS mRNA表達顯著升高，與韋娜和康漫天［11］研究結果一致。對于Clarke等［9］報道的SFA對FAS的表達沒有抑制作用，實驗結果的差異可能與本研究未對碳水化合物的攝入量做特別調整，同時動物實驗之間所選取的大鼠類型、干預飼料中的脂肪供能比、膳食干預時間以及脂肪酸的配比不一致等原因有關。

PPAR是核受體超家族成員中的一員，PPARα是肝臟中PPAR的主要形式，對體內脂肪酸和膽固醇代謝、膽固醇轉運以及血漿載脂蛋白水平均有調控作用，因此，在脂質代謝的調節過程中起著重要作用。PPARα能與視黃醇X受體α（retinoid X receptor alpha，RXRα）形成異源二聚體，識別靶基因上游的過氧化物酶體增殖劑反應元件（peroxisome proliferator response element，PPRE），并啟動靶基因的轉錄，從而引起過氧化物酶體增殖以及脂肪酸途徑相關基因的活性和表達增強。有研究發現，PPARα激活后可促進膽固醇向膽酸的轉化以降低血膽固醇水平，并可以通過調節脂蛋白代謝而改變血漿中脂肪酸和膽固醇的轉運水平。Clarke［12］研究發現，膳食SFA與MUFA干預對PPARα的表達無顯著影響，但PUFA尤其是n－3系的PUFA能有效升高PPARα的表達。進一步研究表明，PUFA是PPARα的內源性配體［13］，可有效激活PPARα并誘導PPARαmRNA的高表達［14］，從而促進乳糜微粒、LDL－C和VLDL－C的代謝以及脂肪酸的β－氧化，并通過增加肝臟ApoA－I的表達來有效升高HDL－C的水平。

本研究發現，不同種類及配比的膳食脂肪酸對大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達的影響不同。與對照組比較，SFA組和MUFA組大鼠的PPARαmRNA表達無明顯變化（P＞0.05）；n－6PUFA組、n－3PUFA組和1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達顯著增加（P＜0.05），說明n－6PUFA、n－3 PUFA膳食能明顯促進PPARαmRNA的表達。同時，與n－6 PUFA組比較，n－3PUFA組和1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達增加更顯著（P＜0.01）。因此，SFA和MUFA對PPARα的基因表達沒有顯著的調控作用，而PUFA作為PPARα的內源性配體能夠有效增強PPARαmRNA的表達。在相同的總脂肪含量下，n－3PUFA 和1∶1n－6／n－3配比的膳食干預效果優于n－6PUFA。這與以往的實驗結果基本一致。

綜上所述，SFA、MUFA主要是通過FAS途徑來調控機體的脂質代謝，它們對PPARα的表達無明顯影響。與對照組比較，SFA能非常顯著地升高FAS mRNA的表達（P＜0.05），而MUFA能顯著降低FAS的基因表達（P＜0.05）。PUFA調節血脂的效應更加全面，能夠顯著降低脂質合成中的關鍵酶FAS的表達同時升高PPARα的表達。

［1］ He J，Gu D，Wu X，et al.Major causes of death among men and women in China［J］.N Engl J Med，2005，353（11）：1124－1134.

［2］ Tattersall MC，Karmali KN，Gangnon RE，et al.The population effects of the global cardiovascular risk model in United States adults：findings from the National Health and Nutrition Surveys，2005－2006［J］.J Clin Lipidol，2011，5（3）：166－172.

［3］ Genser B，Dias KC，Siekmeier R，et al.Lipoprotein（a）and risk of cardiovascular disease——a systematic review and meta analysis of prospective studies［J］.Clin Lab，2011，57（3／4）：143－156.

［4］ 時皎皎，糜漫天，韋娜，等.不同脂肪酸構成比對大鼠血脂影響的研究［J］.第三軍醫大學學報，2007，29（9）：824－827.

［5］ 于紅燕，李燕.多不飽和脂肪酸與肝臟脂質代謝的調控［J］.國際藥學研究雜志，2008，35（2）：120－123.

［6］ 艾正琳，陳東風，劉重陽，等.固醇調節元件結合蛋白－1c在大鼠非酒精性脂肪性肝炎中的表達及意義［J］.重慶醫學，2007，36（8）：695－697.

［7］ Yang ZH，Miyahara H，Takemura S，et al.Dietary saury oil reduces hyperglycemia and hyperlipidemia in diabetic KKAy mice and in diet－induced obese C57BL／6Jmice by altering gene expression［J］.Lipids，2011，46（5）：425－434.

［8］ Hiller B，Herdmann A，Nuernberg K.Dietary n－3fatty acids significantly suppress lipogenesis in bovine muscle and adipose tissue：a functional genomics approach［J］.Lipids，2011，46（7）：557－567.

［9］ Clarke SD，Armstrong MK，Jump DB.Dietary polyunsaturated fats uniquely suppress rat liver fatty acid synthase and S14mRNA content［J］.J Nutr，1990，120（2）：225－231.

［10］成廷水.日糧PUFA對脂肪酸合成酶（蛋白）基因表達作用研究［J］.中國飼料，2004，15（7）：11－13.

［11］韋娜，糜漫天.n－6／n－3多不飽和脂肪酸不同比例對乳腺癌細胞脂代謝調控基因的影響［J］.第三軍醫大學學報，2006，28（7）：652－655.

［12］Clarke SD.Polyunsaturated fatty acid regulation of gene transcription：a molecular mechanism to improve the metabolic syndrome［J］.J Nutr，2001，131（4）：1129－1132.

［13］Sampath H，Ntambi JM.Ployunsaturated fatty acid regulation of gene expression［J］.Nutr Rev，2004，62（9）：333－339.

［14］葉華，王繼文，羅輝.PUFA對脂肪代謝基因表達的影響及其作用機制［J］.安徽農業科學，2006，34（15）：3689－3691.