Vimentin介導LMP1在鼻咽上皮與鼻咽癌中的表達意義*

彭云吉 張志偉 趙強 劉重元 張婕 陳家明 賀修勝

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma， NPC)是我國南方和東南亞地區高發的惡性腫瘤之一，其發生與EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)感染有著密切的關系[1]。EBV編碼的潛伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1， LMP1)是公認的致瘤蛋白[2]。筆者前期采用雙向凝膠電泳和質譜鑒定，篩選到LMP1調節的Vimentin蛋白[3]，為了解LMP1-CTAR3與調節蛋白質在組織中的相關性，本文采用免疫組織化學染色檢測LMP1調節的Vimentin蛋白在鼻咽上皮和鼻咽癌中的表達，擬揭示蛋白質之間的相互作用規律。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2009年8月-2010年10月南華大學附一醫院病理確診的鼻咽上皮組織石蠟塊30例(其中男18例，女12例，平均年齡35歲)和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織石蠟塊60例(其中男41例，女19例，平均年齡44.5歲)。

1.2 免疫組織化學染色 將制備好的石蠟切片58 ℃隔水式恒溫培養箱中過夜；二甲苯脫蠟兩次后水化；PBS洗片3次，每次3 min；將切片浸入盛有枸櫞酸鹽緩沖液容器中微波爐加熱進行抗原修復；加3%過氧化物酶阻斷液，37 ℃ 15 min；PBS洗片3次，每次3 min；加足量非免疫性動物血清，37 ℃ 10 min；分別滴加一抗(抗LMP1蛋白與Vimentin蛋白抗體均為福建邁新生物技術有限公司產品，編號：MAB-0063和 RMA-0547，克隆號：CS1-4和 SP20)，置濕盒中4 ℃冰箱過夜；滴加生物素標記的二抗，37 ℃ 15 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37 ℃ 15 min；DAB顯色、蘇木素復染、返藍、脫水、透明，封片，顯微鏡觀察、照相。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理，Vimentin蛋白的表達采用 χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LMP1蛋白在鼻咽上皮組織及鼻咽低分化鱗狀細胞癌中的表達 LMP1主要在細胞膜與細胞漿中表達(結果未顯示)，其中鼻咽上皮細胞的表達率為73.3%，而鼻咽低分化鱗狀細胞癌中表率為90%，提示慢性鼻炎和鼻咽低分化鱗狀細胞癌患者中EBV感染率高。見表1。

2.2 Vimentin蛋白在鼻咽上皮組織與鼻咽低分化鱗狀細胞癌中的表達 Vimentin蛋白表達于細胞漿(見圖1、2)，與LMP1(-)組織比較，Vimentin蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮組織與鼻咽低分化鱗狀細胞癌中表達升高(P<0.05)，提示LMP1促進鼻咽上皮組織與鼻咽低分化鱗狀細胞癌中Vimentin蛋白的表達。見表1。

圖1 Vimentin蛋白在鼻咽上皮組織中的表達(SP染色法，400倍)

圖2 Vimentin蛋白在鼻咽低分化鱗狀細胞癌中的表達(SP染色法，400倍)

表1 鼻咽上皮與鼻咽低分化鱗狀細胞癌中LMP1蛋白和Vimentin蛋白的表達

3 討論

鼻咽癌的發生與EB病毒感染、飲食、地理及遺傳等因素有關，涉及多基因、多途徑和多階段的復雜生物學過程，屬于一種多基因遺傳性疾病[1-2]。為了解LMP1在鼻咽癌發生發展中的作用機制，筆者前期工作獲得22個LMP1調節的蛋白質，如Vimentin蛋白等[3]。為了證實LMP1對不同蛋白質表達的影響，檢測了Vimentin蛋白在鼻咽上皮和鼻咽癌中的表達情況，為闡明LMP1在鼻咽癌發生發展中的作用機制提供了實驗依據。

波形蛋白(Vimentin)是一種中間絲蛋白，為細胞骨架成分，廣泛存在于間充質細胞及中胚層來源的細胞中，其一端與核膜相連，另一端與細胞表面處的橋粒或半橋粒相連，將細胞核和細胞器維持在特定的空間，主要起支撐作用[4]。Vimentin蛋白在細胞內分布很廣，與微管、微絲等形成完整的細胞支撐網絡[5]。大量資料表明[6]，Vimentin蛋白在多種人類上皮腫瘤如腎癌、甲狀腺、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等異常表達。有研究證實，乳腺癌中Vimentin蛋白表達上調與腫瘤局部浸潤和轉移存在密切關系[7]。本研究結果顯示，Vimentin蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮組織與鼻咽低分化鱗狀細胞癌升高，提示LMP1可促進鼻咽上皮與鼻咽低分化鱗狀細胞癌中Vimentin蛋白的表達。Vimentin蛋白的表達升高提示，LMP1可促進中間絲表達，誘導腫瘤侵襲和轉移，使上皮細胞或癌細胞發生的上皮－間質轉化[8]。LMP1介導的上皮－間質轉化可能促進惡性增殖前鼻咽上皮細胞的惡變[9]。轉化生長因子-β涉及正常上皮-間質轉化，伴隨著細胞骨架重塑、E-鈣粘蛋白表達下降及Vimentin蛋白表達升高[10]。結合鼻咽低分化鱗狀細胞癌中EBV的高感染及易早期轉移等特點，推測LMP1上調Vimentin蛋白的表達，在促進上皮細胞惡變及在癌細胞轉移中起十分重要的作用，但具體機制尚待進一步的研究。

[1] Xu J， Wan X B， Huang X F， et al. Serologic antienzyme rate of Epstein-Barr virus DNase-specific neutralizing antibody segregates TNM classification in nasopharyngeal carcinoma[J]. J Clin Oncol，2010，28(35):5202-5209.

[2] Repic A M， Shi M， Scott R S， et al. Augmented latent membrane protein 1 expression from Epstein-Barr virus episomes with minimal terminal repeats[J]. J Virol，2010，84(5):2236-2244.

[3] 張志偉，張瓊，余艷輝，等.EB病毒LMP1-CTAR3對NP69細胞增殖和蛋白表達的影響[J].生物化學與生物物理學進展，2009，36(5):580-586.

[4] Minin A A， Moldaver M V. Intermediate vimentin filaments and their role in intracellular organelle distribution[J]. Biochemistry，2008，73(13):1453-1466.

[5] 鄭杰.中間絲與腫瘤病理診斷[J].診斷病理學雜志，1998，5(4):247-249.

[6] Dutsch-Wicherek M. RCAS1， MT， and vimentin as potential markers of tumor microenvironment remodeling[J]. Am J Reprod Immunol，2010，63(3):181-188.

[7] Vora H H， Patel N A， Rajvik K N， et al. Cytokeratin and vimentin expression in breast cancer[J]. Int J Biol Markers，2009，24(1):38-46.

[8] Dong H H， Xiang S， Chen X P， et al. The epithelial-mesenchymal transition promotes transdifferentiation of subcutaneously implanted hepatic oval cells into mesenchymal tumor tissue[J]. Stem Cells Dev，2009，18(9):1293-1298.

[9] Horikawa T， Yoshizaki T， Kondo S， et al. Epstein-Barr Virus latent membrane protein 1 induces Snail and epithelial-mesenchymal transition in metastatic nasopharyngeal carcinoma[J]. Br J Cancer，2011，104(7):1160-1167.

[10] Horikawa T， Yang J， Kondo S， et al. Twist and epithelialmesenchymal transition are induced by the EBV oncoprotein latent membrane protein 1 and are associated with metastatic nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Res，2007，67(5):1970-1978.