甘南州尖頂羊肚菌菌絲體液體發酵培養研究

康小虎，蔡亞東，孫宜法，謝 放，任愛梅，孟憲剛

（蘭州交通大學化學與生物工程學院生物工程系，甘肅 蘭州 730070）

羊肚菌又名羊肚菜，是一種野生名貴食（藥）用真菌，因其菌蓋表面呈許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名。尖頂羊肚菌（Morchella conica）是羊肚菌中非常重要的一類，其菌體內含有多糖等活性成分，能增強人體的免疫功能，具有較強的抗衰老、抗腫瘤等作用[1，2]。我國羊肚菌分布廣泛,主要分布在甘肅、青海、四川、云南、黑龍江等地。甘肅羊肚菌資源主要分布在甘南州、天水、隴南、慶陽等地，其中甘南藏族自治州山區尖頂羊肚菌分布較多，以尖頂羊肚菌（M.conica）、小羊肚菌（M.deliciosa）、小頂羊肚菌 （M.angusticeps）、粗柄羊肚菌 （M.crassipes）最為常見[3]。其中尖頂羊肚菌營養豐富，氨基酸、礦物質和微量元素種類齊全，含量豐富[4]，很有研究價值，但目前關于甘南州羊肚菌的研究開發工作鮮見報道。另一方面，羊肚菌子實體的人工栽培是非常困難的，但所幸的是羊肚菌的菌絲體在營養成分上與子實體相當[5]，因此，研究羊肚菌菌絲體液體發酵培養技術，對甘南州羊肚菌資源的開發利用意義重大。本文研究了甘南藏族自治州尖頂羊肚菌液體發酵培養的最優培養基組分和最佳培養條件，為其工業化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

采自甘肅省甘南州迭部縣的尖頂羊肚菌，由蘭州交通大學種苗工程研究所保存。

1.1.2 培養基

斜面種子培養基（PDA）：馬鈴薯（去皮） 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、瓊脂 18 g·L-1，自然 pH。

液體種子培養基：馬鈴薯（去皮） 100 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏 20 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1、維生素 B10.03 g·L-1，pH 7.0。

液體發酵培養基：葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏10 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1、維生素 B10.03 g·L-1，pH7.0。

1.1.3 主要儀器設備

氣浴恒溫培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫干燥箱、超凈工作臺、電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

斜面菌種接種于PDA平板上，25℃靜置避光培養4 d~5 d，菌絲可長滿平板。

1.2.2 液體菌種培養

從活化好的羊肚菌PDA平板上用打孔器取得約1 cm2的菌絲體，接入到裝有100 mL液體種子培養基的三角瓶（250 mL） 中，置于25℃、100 r·min-1的搖床上避光培養4 d，即可作為液體發酵菌種備用。

1.2.3 液體發酵培養基優化實驗

（1）碳源、氮源單因素篩選試驗

碳源篩選實驗：以2%的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、白砂糖的替液體發酵培養基中的葡萄糖作為碳源，其它組分和液體發酵培養基相同。接種量為10 mL，25℃、120 r·min-1搖瓶培養7 d。重復實驗3次，測定菌絲體生物量。

氮源篩選實驗：以1%的蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨代替液體發酵培養基中的酵母浸膏作為氮源，其它組分和搖瓶發酵培養基相同。接種量為10 mL，25℃、120 r·min-1條件下，搖瓶培養7 d。重復實驗3次，測定菌絲體生物量。

（2）無機鹽篩選實驗

根據王小雄[4]對甘肅甘南州羊肚菌營養成分分析和王新宇[6]對甘南州羊肚菌菌絲體生長的研究，選取KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4以及CaCl2七種無機鹽，設計L8(27)正交試驗，試驗方案見表1。

表1 無機鹽正交試驗方案

（3）液體發酵培養基組分優化實驗

根據碳源、氮源單因素實驗結果和無機鹽正交實驗結果，以干菌絲體得率為考量指標，綜合考慮原料來源和價格因素，選擇影響羊肚菌干菌絲體得率的主因素。碳源為白砂糖，氮源為豆粕粉，無機鹽為 MgSO4·7H2O和KH2PO4。另外，任桂梅[7]等的研究認為維生素B1作為生長因子對食用菌菌絲體的生長影響明顯，故將維生素B1作為生長因子，設計L16(45)正交試驗，試驗方案見表2。

表2 發酵培養基組分正交試驗方案

1.2.4 液體搖瓶發酵條件的優化

在最佳發酵培養基成分的基礎上，以不同溫度、初始pH值、接種量、培養時間和轉速，設計L16(45)正交試驗，以干菌絲體得率為指標，確定最佳發酵條件，試驗方案見表3。

表3 液體發酵條件正交試驗方案

1.2.5 干菌絲體得率的計算

發酵液用紗布過濾，所得菌絲球用去離子水清洗3次~5次，置于80℃烘箱中干燥2 h至恒重，計算干菌絲體得率。干菌絲體得率（P，g·L-1）公式為：

式中：m為干菌絲體質量（g）；v為發酵液體積（L）。

2 結果與分析

2.1 碳源、氮源的單因素篩選實驗結果及分析

2.1.1 碳源篩選實驗

在不同碳源的發酵培養基中，培養7 d后，菌絲體呈現微黃色的菌球，直徑為5 mm~15 mm不等，不同碳源生長條件下獲得的干菌絲體得率的差異如圖1所示。

由圖1中可看出，所選碳源均能培養產生菌絲體。蔗糖、葡萄糖和白砂糖作為碳源獲得的干菌絲體是相對較高的，分別為 6.86 g·L-1、6.55 g·L-1、6.67 g·L-1，三者之間無明顯差異，其主要原因是它們都屬于速效碳源，培養初期（5 d前）菌絲體生長很好，但是以葡萄糖為碳源時，在培養后期（5 d后）菌絲體的自溶現象是最明顯的。其次是玉米粉（5.12 g·L-1），可溶性淀粉最低（3.94 g·L-1）。綜合菌絲體得率、碳源來源、價格等因素考慮，選擇白砂糖作為發酵培養基碳源。

2.1.2 不同氮源生長條件下獲得的干菌絲體得率情況

不同氮源生長條件下所獲得的干菌絲體得率，其差異情況見圖2。

圖1 不同碳源對干菌絲體得率的影響

所選氮源均能產生一定量的菌絲體。蛋白胨、酵母浸膏和豆粕粉為氮源獲得的干菌絲體得率較高，分別是7.63 g·L－1、8.02 g·L－1、7.95 g·L－1，三者之間差異不大，其次是硫酸銨（6.70 g·L－1），氯化銨（5.63 g·L－1）最低。分析原因可能是前三者均屬復合型氮源，其中含有羊肚菌生長因子和微量元素，菌絲體的生長速率較快。綜合考慮不同氮源干菌絲體得率、原料來源、使用成本等因素，選擇豆粕粉為液體發酵培養基氮源。

圖2 不同氮源對羊肚菌干菌絲得率的影響

2.2 無機鹽篩選實驗結果及分析

選取 KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4、MnSO4、CaCl2七種無機鹽，每種無機鹽設2水平，設計L8(27)正交試驗，試驗方案和結果見表4。

以干菌絲體得率為考察指標，極差分析顯示無機鹽對干菌絲體得率影響主次關系 A（KH2PO4）=C（MgSO4·7H2O）＞G（CaCl2）＞B（K2HPO4）＞D（ZnSO4）＞E（FeSO4·7H2O）＞F（MnSO4），其中KH2PO4和MgSO4·7H2O極差值最大，說明這兩種無機鹽對菌絲體生長量影響最大，因此選取這兩種無機鹽為發酵培養基組分。

表4 無機鹽正交試驗結果及分析

2.3 液體發酵培養基組分優化實驗結果及分析

根據碳源、氮源單因素試驗結果和無機鹽正交試驗結果，以干菌絲體得率為考量指標，設計L16(45)正交試驗。試驗因素包括碳源白砂糖、氮源豆粕粉、無機鹽KH2PO4和MgSO4·7H2O，生長因子維生素B1，每因素設四水平，試驗方案及結果見表5。

從表中極差值R可以得到發酵培養基的最佳水平組合A3B3C3D2E3，即白砂糖 30 g·L－1、豆粕粉 15 g·L－1、KH2PO40.75 g·L－1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L－1、維生素 B10.03 g·L－1。

2.4 液體發酵條件的優化

采用優化后的發酵培養基，設計不同溫度、初始pH值、接種量、轉速和培養時間5個因素，每因素四水平，設計L16(45)正交試驗，以干菌絲體得率為考量指標、確定最佳發酵條件，實驗方案及結果見表6。

極差分析結果顯示最佳液體發酵培養條件組合為A3E4B3C2D2，即最佳液體發酵條件為溫度30℃，培養液初始 pH7，接種量 10 mL，轉速 120 r·min－1，培養時間為 8 d。

3 結論

本文通過設計正交試驗對甘南州尖頂羊肚菌液體發酵培養基和培養條件進行優化。確定的最佳培養基配比為白砂糖 30 g·L－1、豆粕粉 15 g·L－1、KH2PO40.75 g·L－1、MgSO4·7H200.5 g·L－1、維生素 B10.03 g·L－1。液體搖瓶發酵的最優條件為溫度30℃，培養液初始pH7，接種量10 mL，轉速 120 r·min－1，培養時間 8 d。

[1]張松.食用菌學[M].廣東：華南理工大學出版社，2000.

[2]李娟，王臻，姚良同，等.羊肚菌多糖研究進展[J].微生物學雜志，2005，25(4)：89－91.

[3]杜品.甘南州林區的大型藥用真菌[J].中國食用菌，1999，19(1)：19－20.

[4]王小雄，付華，鄭尚珍，等.尖頂羊肚菌深層發酵菌絲體營養成分的研究[J].西北師范大學學報，1997，33（2）：38-40.

表5 液體發酵培養基組分正交試驗結果及分析

[5]趙桂云，馬慶斌.羊肚菌液體培養基配方的研究[J].食用菌，2002(6)：15-16.

[6]王新宇，梁祖炳，蒲訓.三種不同羊肚菌菌絲體的生長、蛋白質合成和酯酶同功酶的組成[J].真菌學報，1996，15(3)：220-226.

表6 液體發酵條件正交試驗結果及分析

[7]任桂梅，周茂林，毋楠.維生素B1對幾種擔子菌菌絲體生長的影響[J].安徽農業科學，2007，35(26)：8075-8076.