北京地區杏鮑菇菌株遺傳多樣性的RAPD分析

許 峰，劉 宇，尹永剛，王守現，張英春，趙 爽，耿小麗

（北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京 100097）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側耳，是近年來開發栽培成功、適于工廠化栽培的珍稀食用菌新品種，其風味獨特、營養豐富[1]，能夠產生多種生物活性分子和酶[2]，且其多糖具有較好的降血糖、增強肌體免疫功能、抗腫瘤和抗氧化活性[3]。因此杏鮑菇具有很高食用、藥用、經濟和生態價值，市場前景廣闊。據北京食用菌協會統計，杏鮑菇在北京市場上已經占食用菌總產量的5.01%。

杏鮑菇遺傳多樣性研究的開展，對杏鮑菇優良品種的雜交選育、種質資源的保護有著重要的意義。Ro等[4]、尚曉冬等[5]和劉曉紅等[6]分別對其收集的不同地區的杏鮑菇菌株進行了RAPD技術分析，但是，針對北京地區主要栽種品種和工廠化生產的杏鮑菇菌株的RAPD分析未見報道。為此，本研究應用RAPD分子標記技術，對北京地區24個杏鮑菇菌種進行遺傳多樣性分析，為有效培育杏鮑菇優良新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料

本研究所用菌株的名稱及來源參見表1。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4等化學試劑均為分析純試劑，購自國藥集團北京化學試劑公司；Taq E、dNTP等分子生物學試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司；所用引物由上海生工生物公司（Sangon）合成。

1.1.3 儀器

PCR儀 （Eppendorf Mastercycler Rradien）t、凝膠成像系統 （Bio-Rad）、紫外可見分光光度計 （Labtech UV9100）、電泳儀（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、電子分析天平（奧豪斯）、臺式高速冷凍離心機（Eppendorf 5415R）、移液器（Eppendorf）等。

表1 供試菌株及其來源

1.1.4 培養基

固體綜合PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨 5 g、 KH2PO43 g、MgSO41.5 g、瓊脂 20 g、VB110 mg，水 1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 RAPD分析

取PDA平板上活化7 d~10 d的杏鮑菇菌種，刮取少量菌絲作為試驗材料，DNA的提取參照許峰等[7]的方法，RAPD擴增反應體系及擴增程序參照范英等[8]的方法。取9 μL PCR擴增產物，1.3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠經EB染色后，置于紫外凝膠成像系統上觀察并拍照記錄。

1.2.2 數據處理及分析

同一水平上將擴增出的強帶或可分辨性好的弱帶，均視為擴增陽性賦值“1”，未擴增出條帶視為擴增陰性賦值“0”，用NTSYSpc 2.10軟件進行聚類分析及主坐標分析。

2 結果與分析

2.1 供試菌株RAPD分析結果

以提取的24個供試杏鮑菇菌株的基因組DNA為模板，通過對40條引物的PCR擴增篩選所獲得的9條引物（表2），在供試菌株上電泳效果較好，每個菌株都可以通過PCR擴增出DNA條帶,且條帶穩定、清晰、重復性好、分布合理。9條引物共擴增出142條DNA片段，不同引物擴增出的DNA條帶數從10個~20個不等，其分子量絕大多數為250 bp~2 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態信息 （圖 1）。

表2 RAPD分析用引物

圖1 引物S484對24株杏鮑菇菌株的擴增結果

2.2 供試菌株聚類分析結果

綜合了9條RAPD隨機引物擴增出的142條多態性片段，用NTSYSpc 2.10軟件對24個杏鮑菇供試菌株進行聚類分析，獲得各菌株間的聚類圖，見圖2。

圖2 杏鮑菇菌株的聚類分析圖

在相似系數0.850水平時，可將其余供試菌株分為5大類，第一類包括杏1、杏6和杏22;第二類包括杏2、杏4、杏5、杏8、杏9、杏房山1號、杏14、杏福建（蘭田）、杏10、杏11、杏20、杏21、杏16、杏18、杏19、杏13、杏17；第三類有杏23、杏24；第四類為杏3；第五類為杏7。這與本實驗室的栽培試驗獲得的杏3和杏7子實體形狀與其它菌株相差很大的結果是一致的。其中第二大類中共包括了17個菌株，在相似系數0.900水平時，又分為五小類，第一類包括杏2、杏4、杏5、杏8、杏9、杏房山1號；第二類包括杏10、杏11、杏20、杏21；第三類包括杏16、杏18、杏19；第四類只有杏13；第五類只有杏17。杏鮑菇菌株的主坐標分析見圖3。

圖3 杏鮑菇菌株的主坐標分析

對24份材料RAPD標記的原始矩陣進行主坐標分析，前3個主坐標的貢獻率分別為17.22%、15.49%和9.55%。從前3個主坐標的三維散點圖可以看出，主坐標分析和聚類分析所得結果基本一致。

3 結論與討論

筆者收集了北京地區24個杏鮑菇栽培品種，并對其基因組DNA進行RAPD擴增和進行遺傳多樣性分析。聚類分析結果表明，在相似系數為0.850的水平時，可將24個供試菌株分為5大類；主坐標分析結果與聚類分析基本一致。

RAPD技術是1990年由Welsh J和Williams JGK同時建立起來的操作簡便、靈敏快速、多態性好的遺傳標記[9]。近年來越來越多的研究者將其應用于食用菌類，如香菇、木耳、杏鮑菇等[4，10，11]的種間和種內不同菌株的鑒定研究。劉曉紅等[8]應用該技術對國內不同地區的杏鮑菇品種進行遺傳多樣性分析，將23個供試菌株分為五類，并且有一類菌株較多；分析表明該類菌株由于引種可能來源于同一地區，這與本研究獲得的結果一致，說明本研究收集到的北京地區的主要栽培品種的遺傳多樣性與全國范圍的品種多樣性一致。

此外，第二大類為生產中主要的栽培菌株，本研究結果表明這些菌株的遺傳差異性較小，說明很多菌株都是通過1個或2個優良菌株通過雜交育種手段獲得。同時本研究結果還表明，RAPD技術能有效地把雜交菌株與親本菌株區分開來。

[1]Rodriguez Estrada AE,Jimenez Gasco MM,Royse DJ.Pleurotus eryngii species complex:Sequence analysis and phylogeny based on partial EF1α and RPB2 genes[J].Fungal Biol.,2010,114(5-6):421-428.

[2]Shibata T,Kudou M,Hoshi Y,et al.Isolation and characterization of a novel two-component hemolysin,erylysin A and B,from an edible mushroom,Pleurotus eryngii[J].Toxicon,2010,56(8):1436-1442.

[3]Jung HY,Bae IY,Lee S,et al.Effect of the degree of sulfation on the physicochemical and biological properties of Pleurotus eryngii polysaccharides[J].Food Hydrocolloid,2011,25(5):1291-1295.

[4]Ro HS,Kim SS,Ryu JS,et al.Comparative studies on the diversity of the edible mushroom Pleurotus eryngii:ITS sequence analysis,RAPD fingerprinting,and physiological characteristics[J].Mycol.Res.,2007,111(6):710-715.

[5]尚曉冬，宋春艷，沈學香，等.杏鮑菇菌株RAPD指紋圖譜分析[J].食用菌學報，2009，16(3)：1-4.

[6]劉曉紅，蔡為明，葉愛華，等.杏鮑菇種質資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].安徽農業科學，2009，37(32)：15728-15729.

[7]許峰，劉宇，王守現，等.一種適于PCR反應的快速提取食用菌基因組DNA提取方法[J].生物技術，2011，21(2)：43-44.

[8]許峰，劉宇，王守現，等.北京地區白靈菇菌株的RAPD分析[J].生物技術，2010，38(15)：21-23.

[9]范英，鐘成剛，閆淑珍，等.竹黃菌基因組RAPD分子標記體系的建立[J].生物技術，2010，38(15)：23-26.

[10]Fu LZ,Zhang HY,Wu XQ,et al.Evaluation of genetic diversity in Lentinula edodes strains using RAPD,ISSR and SRAP markers[J].World J.Microb.Biotech.,2010,26(4):709-716.

[11]Yan PS,Luo XC,Zhou Q.RAPD molecular differentiation of the cultivated strains of the jelly mushrooms,Auricularia auricula and A.polytricha[J].World J Microb.Biotech.,2004,20(8):795-799.