敲低Aurora A基因增強替莫唑胺抗人腦膠質瘤U87細胞的作用☆

陳云鵬 張弩 丁之明 夏之柏

正常細胞分裂過程的任何偏差會造成中心體擴增、染色體異常分離以及非整倍體的產生，導致基因組不穩定，從而誘發腫瘤［1］。近年來，一種新的參與有絲分裂的絲氨酸蘇氨酸激酶家族——Aurora家族逐漸被認識，其分為3類：Aurora-A、Aurora-B 和 Aurora-C，其中 Aurora-A 最受關注［2］。研究發現Aurora A過表達不但使某些腫瘤如卵巢癌的侵襲性和轉移率明顯提高，而且與患者預后直接相關［3－4］。敲低 Aurora A 在喉癌細胞的表達可使其對順鉑的敏感性增加［5］。我們先前的研究也發現Aurora A在膠質瘤中存在過表達現象。在此基礎上，本文研究敲低Aurora A基因聯合替莫唑胺（temozolomide，TMZ）治療后細胞增殖變化，探討其作為腫瘤基因治療新靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 U87細胞購自中國科學院細胞研究所；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；抗Aurora A抗體購自美國Bethyl公司；抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶耦聯的抗兔IgG和抗鼠IgG購自武漢博士德；替莫唑胺由美國Schering-Plough公司提供；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 購自美國 Sigma 公司；pshRNA Lentivector質粒、包裝質粒、基于人免疫缺陷病毒骨架的慢病毒包裝系統 （Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit）購自美國GeneCopoeia公司；中量質粒DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；人膽囊收縮素八肽（CCK8）購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養 U87細胞培養于含10%新生牛血清的高糖DMEM培養液，內含青霉素、鏈霉素，置37℃、5%CO2條件下常規培養。

1.3 細胞轉染 構建Aurora A shRNA質粒載體（廣州復能基因公司協助構建）。按說明書用Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit慢病毒包裝系統進行慢病毒感染。慢病毒感染24 h后對樣品進行換液處理；48 h后用熒光顯微鏡檢查GFP表達；96 h開始添加濃度為7.5 μg/L的嘌呤霉素進行篩選。熒光顯微鏡下觀察轉染了Aurora A shRNA和空載體的U87細胞是否有熒光。細胞分未轉染組（U87）、 空載體組 （U87-GFP） 及轉染組（U87-shRNA）

1.4 RT-PCR檢測Aurora A mRNA表達 提取3組細胞總RNA，按Promega試劑盒說明進行反轉錄和PCR擴增。Aurora A上游5′-AATCTGGAGGCAAGGTTCGACTG-3′，下游 5′-TGGGAGATAAGT GGTTAAGGAGG-3′，GAPDH為內參照。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下檢測并拍照。

1.5 Western blot檢測 Aurora A蛋白表達 提取3組細胞總蛋白，測定濃度；蛋白樣品（每泳道50 μg）行 7.5%SDS PAGE 電泳，100 mV 轉膜。牛奶封閉，加入 Aurora A 抗體（1∶200）和 β-actin 抗體（1∶500）4℃過夜，次日加入 HRP 標記二抗（1∶5000），37℃1 h，洗膜后ECL發光，X膠片曝光、顯影。

1.6 CCK8法檢測細胞活性 替莫唑胺用DMSO配制成濃度為 100 mmol/L的溶液，－20℃保存，臨用時用全培養液稀釋至所需濃度。取對數生長期的未轉染組、空載體組和轉染組細胞接種于96孔培養板，細胞密度 2 × 104/mL，置 37℃、5%CO2條件下培養24 h，分別加入濃度依次為10、25、50、100、200 μmol/L 的 TMZ，每孔加 100 μL 并設置空白對照組及陰性對照組（二甲基亞砜），每個藥物濃度設5個平行孔，繼續培養72 h。另取未轉染組、空載體組和轉染組細胞，加入 50 μmol/L TMZ分別作用24、48、72 h。完成處理后每孔加入CCK8試劑10 μL，37℃繼續培養 2 h，全自動酶標儀檢測波長450 nm的吸光度OD值。細胞生長抑制率（%）＝（1－加藥組OD平均值/對照組OD平均值）×100%。實驗重復3次。做對數曲線算出IC50值。

1.7 流式細胞儀分析細胞 取對數生長期的未轉染組、空載體組和轉染組細胞，用TMZ同前處理。處理完成后，將細胞收集于流式管中，PBS洗滌，70%冰乙醇固定，再用PBS洗滌2次，每管加入預先配制好的PI染液l mL，室溫避光5 h，上機檢測細胞周期。

2 結果

2.1 Aurora A轉染U87細胞的鑒定 熒光顯微鏡下轉染組和空載體組細胞帶綠色熒光蛋白，表明轉染成功（圖1）。用ImageJ軟件分析條帶灰度。RT-PCR結果灰度值分別為：未轉染組 （31023±926）、 空載體組 （30124±1074）、 轉染組 （896±172），各組間的差異有統計學意義（F＝2159.63，P＜0.001），兩兩比較顯示轉染組灰度值低于其他兩組（P ＜ 0.001）；Western blot結果灰度值分別為：未轉染組 （39556±2306）、 空載體組 （39348±2738）、轉染組（574±96），各組間的差異有統計學意義（F＝589.36，P ＜ 0.001），兩兩比較顯示轉染組灰度值低于其他兩組（P＜0.001）。實驗結果表明相對于空載體組及未轉染組，轉染組的Aurora A mRNA和蛋白表達均降低（圖2、3）。

2.2 細胞生長抑制的比較 表1顯示陰性對照組（二甲基亞砜）內，未轉染組、空載體組、轉染組間無統計學差異（F＝0.35，P ＞ 0.05）。表1、圖 4A 表明在一定TMZ濃度范圍內各組細胞生長抑制率隨著濃度的升高而增加，呈現濃度依賴性。經不同濃度的替莫唑胺作用不同時間后，轉染組細胞的TMZ劑量反應曲線左移。經直線回歸方程計算，未轉染組、空載體組、轉染組的半數有效抑制濃度（IC50） 分別為：（43.38±2.15）μmol/L、（43.76±1.52）μmol/L、（22.20±2.34）μmol/L，各組間差異具有統計學意義（F＝184.06，P ＜ 0.001），兩兩比較顯示轉染組半數有效抑制濃度（IC50）低于其他兩組（P ＜ 0.001）。用 50 μmol/L TMZ 處理各組細胞，相同時間點各組的差異均有統計學意義，兩兩比較顯示，相同時間點下轉染組的細胞抑制均高于空載體組和未轉染組（P ＜ 0.01）（表2、圖 4B）。

圖1 轉染組和空載體組細胞（×200，熒光顯微鏡）。A：轉染組（明場）；B：轉染組（熒光）；C：空載體組（明場）；D：空載體組（熒光）

圖2 轉染前后U87細胞Aurora A mRNA表達（RT-PCR）

圖3 轉染前后U87細胞Aurora A蛋白表達（Western blot）

圖4 替莫唑胺對未轉染組、空載體組與轉染組細胞增殖的影響

表1 不同濃度替莫唑胺作用于未轉染組、空載體組與轉染組細胞72 h的生長抑制率

表2 未轉染組、空載體組與轉染組細胞在50 μmol/L替莫唑胺作用下不同時間點的細胞生長抑制率

表3 未轉染組、空載體組與轉染組接受50 μmol/L替莫唑胺及對照（DMSO）處理72 h細胞周期變化（%）

2.3 細胞凋亡的比較 表3顯示兩種不同處理下未轉染組、空載體組和轉染組各組間G2/M期比例的差異均有統計學意義，兩兩比較顯示兩種不同處理下轉染組G2/M期比例均高于其他兩組 （P＜0.01）。敲低Aurora A聯合TMZ比單獨敲低Aurora A或者單獨 TMZ 處理 G2/M 期阻滯明顯（P ＜ 0.01）。

3 討論

Aurora A位于重要的癌基因區域20q13，在有絲分裂期定位于中心體和紡錘體，在中心體復制、分離、成熟的過程中發揮重要作用。Aurora A高表達通過干擾紡錘體組裝的檢測點，引起胞質分裂中止，最終出現中心體擴增形成非整倍體細胞。少數非整倍體細胞生存下來，其生長優勢高于鄰近的正常細胞，導致形成腫瘤的可能性大大增加［6］。

我們發現Aurora A基因在膠質瘤細胞高表達，敲低其表達后，細胞增殖明顯降低。Cammareri等［7］報道，直腸癌高表達Aurora A基因，沉默其表達后細胞增殖也明顯下降，對5-FU的敏感性也明顯增加。Lehman NL等［8］發現Aurora A過表達可促進喉鱗狀上皮癌細胞的增殖和轉移，敲低Aurora A基因表達可使喉鱗狀上皮癌對順鉑的敏感性增加。我們發現敲低Aurora A基因不但使替莫唑胺對膠質瘤細胞的IC50明顯降低，而且也可使細胞經較低濃度替莫唑胺作用后增殖活性顯著下降。綜上所述，敲低Aurora A基因表達不但能使多種腫瘤增殖活性下降，而且能增加腫瘤對化療的敏感性。

Aurora A基因表達下調增加腫瘤細胞化療敏感性的機理尚不清楚。我們的研究證實敲低Aurora A可使腫瘤細胞的G2/M比例增加，協同TMZ處理腫瘤細胞G2/M比例進一步增加，但凋亡并無增加。Marumoto等［9］在非霍奇金淋巴瘤中發現 Aurora A過表達破壞細胞G2/M檢查點的功能，導致細胞周期無法阻滯于G2/M期；并使細胞在DNA受損情況下繼續進行分裂，產生惡性轉化。故敲低Aurora A的表達，可能是通過恢復細胞G2/M檢查點的功能，使其得以發揮自身的監控作用，產生G2/M期阻滯，導致細胞生長抑制。Lee S 等［10］認為 Aurora A可對p53的315位絲氨酸磷酸化，導致其通過泛素化途徑降解。敲低Aurora A的表達可能恢復p53功能，產生G2/M期阻滯，達到抑制增殖的作用。p53功能降低或缺失，bcl-2表達水平過高，以及表皮生長因子受體表達過高可干擾細胞對DNA損傷的反應，降低對化療藥物的敏感性［11］。誘導惡性膠質瘤細胞發生自噬是替莫唑胺的重要作用。由于自噬的特點，藥物誘導腫瘤細胞產生自噬會出現兩種不同的結果：一是保護腫瘤細胞免受放化療損傷，另一種是啟動細胞主動性的Ⅱ型細胞死亡程序。自噬早期抑制劑抑制替莫唑胺誘導自噬的同時可削弱其抗腫瘤效應，而自噬晚期抑制劑可誘導凋亡增加替莫唑胺抗腫瘤效應［12］。

Zhang J等［13］發現在替莫唑胺耐藥細胞株中U373VR細胞中MGMT蛋白上調；SNB19VR細胞中的hMSH6表達缺失造成的MMR損傷。體外和臨床試驗研究均證實腫瘤的烷化劑抵抗性是由MGMT過表達或MMR缺陷介導的。而Aurora A的上調都可以使MGMT過表達或MMR缺陷介導，使腫瘤獲得對替莫唑胺導致的損傷耐受或修復的能力。因此敲低Aurora A除可延長細胞有絲分裂G2期外還有下調MGMT修復MMR的功能，從而增強替莫唑胺的抗腫瘤作用。Aurora A的敲低不僅其本身就具有抗腫瘤作用，而且能增強腫瘤對替莫唑胺等化療藥物的敏感性，因此Aurora A基因將是未來膠質瘤基因治療和聯合化療的重要靶基因。

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［8］Lehman NL，O'Donnell JP，Whiteley LJ，et al.Aurora A is differentially expressed in gliomas，is associated with patient survival in glioblastoma and is a potential chemotherapeutic target in gliomas［J］.Cell Cycle，2012，11（3）：489－502.

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