特異性siRNA下調Cr－1基因表達對人結直腸癌細胞侵襲的影響

朱祥 馬圭 祁衛東 蔣鵬程 范鈺

（江蘇大學附屬人民醫院腫瘤研究所 江蘇鎮江 212002）

Cripto－1基因最初是通過克隆人畸胎瘤細胞系中的互補DNA文庫得到，故相應地命名為畸胎瘤衍生生長因子－1（teratocarcinoma－derived growth factor－1，TDGF1），定位在人類染色體3p21.3［1］，編碼cripto蛋白，故一般稱為Cr－1基因。研究發現，Cr－1基因在許多惡性實體瘤如結直腸癌、胃癌、胰腺癌、陰莖癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈過度表達，而它在正常組織中都不表達或低表達［2，3］。有研究發現，Cr－1基因與某些腫瘤如結直腸癌［4～8］侵襲有關。但國內目前尚無關于此基因在結直腸癌細胞侵襲方面的研究。

本課題組借助于RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術，以化學合成Cr－1基因小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染處理結直腸癌SW480細胞，觀察了Cr－1基因siRNA轉染對癌細胞侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人結直腸癌SW480細胞，本院組織生物標本庫凍存。Cr－1抗體購自Santa Cruz公司。TRIzol，RNase inhibitor，逆轉錄酶SSRTⅡ，Taq酶和轉染試劑Oligofectamine購自Invitrogen公司。

1.1.2 siRNA序列 根據Cr－1基因mRNA序列特點，設計合成了6個siRNA。另外，設計了一個錯配 siRNA（正義 鏈：5＇－UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd－3 ＇； 反 義 鏈： 5 ＇－ACGUGACACGUUCGGAGAATdTdT－3＇）作為對 照。所有siRNA均由美國Dharmacon公司采用化學合成方法合成。Cripto－1siRNA序列見表1。

表1 Cripto－1siRNA 序列

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染處理 人結直腸癌SW480細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液、37℃、5%CO2、飽和濕度環境的條件下培養。轉染前1天，將1.0×105對數期生長的細胞接種于24孔培養板，1ml／well，培養過夜。次日進行轉染。基本操作按說明書進行。細胞分組：（1）空白對照組（Con－A）：未經任何處理的結直腸癌細胞；（2）空載對照組（Con－B）：即脂質體對照組；（3）錯配對照組（Scr－siRNA）；（4）siRNA 組：10%胎牛血清的 RBMI 1640中含不同濃度（3.125、6.25、12.5nmol／L）的已用脂質體包埋的siRNA。

1.2.2 結直腸癌細胞Cr－1基因檢測