促紅細胞生成素預處理對氧糖剝奪后星形膠質細胞水腫及AQP4表達的影響☆

唐兆華 廖正步 支興剛 謝延風 石全紅 何朝暉 詹彥

腦水腫是顱腦創傷、缺血性腦卒中等眾多神經系統疾病共同的病理過程。顱腦疾病常常伴發的神經細胞缺血缺氧則是引起腦水腫的最重要病理基礎之一。促紅細胞生成素是血液系統主要的造血因子。近年國內外及本課題組前期的體外研究發現，重組人促紅細胞生成素(recombinanthuman erythropoietin，rhEPO)在神經系統中具有減輕創傷性腦水腫等重要的神經保護功能[1-4]。新近研究顯示水通道蛋白 4(aquaporin4，AQP4)是中樞神經系統最豐富的水通道蛋白，在腦內水電解質平衡的調節上發揮著重要作用[5-6]，而且已有最新研究表明rhEPO可以調節AQP介導的體外星形膠質細胞水通透性的改變[4]。星形膠質細胞是腦組織中占絕大多數比例的神經細胞，它的水腫會造成嚴重的腦損害[7]。所以，本研究旨在觀察rhEPO預處理對氧糖剝奪后星形膠質細胞水腫及其AQP4表達的影響，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 新生2 d內的SD大鼠(重慶醫科大學實驗動物中心提供)50只，胎牛血清(美國Gibco)，無糖DMEM培養基(中國 鈕因華信)，神經膠質原纖維酸性蛋白(美國Sigma)，乳酸脫氫酶試劑盒(美國 Hyclone)，RT-PCR試劑盒(美國 Ferments)，AQP4 多克隆抗體(美國 Santa Cruz)。

1.2 星形膠質細胞原代培養[8]取新生2 d內的SD大鼠，取大腦皮層剪碎并消化后，接種到培養瓶中，置于37℃，20%O2的孵箱1 h，將細胞懸液換至有多聚賴氨酸涂底的培養瓶，隔2 d換液，7 d后 37℃，180 r／min 水平振蕩 10 h，換液，細胞長滿至95%瓶底后傳代，待培養至第三代時，用特異性GFAP對星形膠質細胞行免疫熒光染色，鑒定成熟、純化的星形膠質細胞。

1.3 氧糖剝奪模型的建立[9]去掉星形膠質細胞的含血清的DMEM／F12培養基，用PBS沖洗 2次，換為未添加血清的無糖DMEM培養基，置于1%O2的孵箱(美國 Thermo)行5 h時長的氧糖剝奪，此后再給細胞換回含血清的DMEM／F12培養基，并于20%O2的孵箱行復氧培養，至0.5 h、2 h、8 h、24 h四個時間點時進行觀察及實驗。

1.4 實驗分組 將星形膠質細胞分為3個組：①正常組，未行氧糖剝奪及rhEPO預處理的星形膠質細胞；②模型組，未經rhEPO預處理，直接行氧糖剝奪的星形膠質細胞；③rhEPO預處理組，先在星形膠質細胞的正常培養基中加入1IU／mL rhEPO

作用2 h后，再對其進行氧糖剝奪(在0.1、1和10 IU／mL三種濃度的預實驗中1IU／mL rhEPO保護作用最強)。每個分組在每個時間點均有3～5個隨機抽樣的獨立樣本。

1.5 星形膠質細胞形態觀察 用光學顯微鏡(德國Leica)直接觀察氧糖剝奪并復氧培養至各時間點細胞的形態變化。

1.6 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率測定 各組星形膠質細胞分別在氧糖剝奪后復氧培養至各時間點進行LDH活性測定，取每孔細胞培養液約0.3 mL，按照乳酸脫氫酶試劑盒說明書操作，測試樣品中LDH的活性，LDH漏出率＝培養基LDH×100%／(胞漿LDH+培養基 LDH)。

1.7 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測星形膠質細胞AQP4 mRNA的表達 按Trizol試劑說明提取細胞總RNA，采用MMLV逆轉錄試劑盒按操作說明逆轉錄為cDNA，產物進行PCR。AQP4引物： 上游 5′CCTACAGAACCAAGGCGTAA3′，下游5′TCCCTGGAAATGACTGAGAA3′，擴增片段長 261 bp；β-肌動蛋白(β-actin)引物：上游 5′ACCTCCAACACCCCAGCCATG3′，下游 5′CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG3′，擴增片段長 691 bp。反應體系25 μL，58℃退火 45 s，共循環30次。PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，長波紫外燈下觀測照相。用Quantity One軟件分析電泳條帶平均光密度值，AQP4／β-actin積分A值為AQP4 mRNA表達水平。

1.8 Western Blot法檢測星形膠質細胞AQP4蛋白的表達 分別消化各組在不同時間點的細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解20 min，測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，沸水變性5min。每孔加入40 μg蛋白樣品電泳，用PDVF膜轉膜，封閉后加一抗AQP4(1∶300)，4℃孵育過夜，加入 HRP 標記的二抗，37℃孵育1 h，ECL顯影，GAPDH作為內對照參數。用Quantity One軟件分析熒光條帶平均光密度值，AQP4／β-actin積分 A值為 AQP4蛋白表達水平。

1.9 統計學分析 計量資料采用均數±標準差表示，采用SPSS 13.0進行分析，組間比較均采用單因素方差分析，兩兩比較均采用Turkey法，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 星型膠質細胞的原代培養及鑒定 光學顯微鏡下可見原代成熟的星形膠質細胞成片生長，形態較扁而大，呈多邊不規則形，有細長突起，細胞間連接緊密(圖1 A)。對培養成功的原代星形膠質細胞，用特異性GFAP抗體進行免疫熒光染色鑒定，熒光顯微鏡下見熒光陽性細胞比例＞98%，滿足后續實驗要求(圖1 B)。

2.2 光學顯微鏡觀察星形膠質細胞形態改變 模型組星形膠質細胞在5 h氧糖剝奪后復氧培養至0.5 h時，出現邊緣皺縮，折光率增高，胞體略增大，胞內形成較多顆粒樣物質，至2 h時形態變化加重，細胞明顯腫脹變圓，折光率明顯增高，突起增粗縮短，少量細胞呈凝固性壞死，8 h時腫脹的細胞稍有緩解，部分壞死細胞已脫落懸浮，細胞數量減少，至24 h時腫脹雖有所緩解，但較正常細胞仍有明顯腫脹(圖2 A～D)。

rhEPO預處理組星形膠質細胞在5 h氧糖剝奪后復氧培養至0.5 h時胞質內出現少量顆粒樣物質，至2 h時細胞邊緣皺縮，輪廓加強，僅部分胞體及足突輕度腫脹，折光率增高，但形態變化明顯輕于模型組，至8 h時細胞腫脹減輕，未見明顯壞死細胞，24 h時大部分細胞基本恢復扁平、多邊形，有細長突起的正常形態(圖2 E～H)。

2.3 星形膠質細胞LDH漏出率變化 LDH漏出率在5 h時長的氧糖剝奪后，隨著時間延長，呈不斷增高趨勢(24 h時：F＝80.45，P＜0.01)。 與正常組相比，模型組LDH漏出率氧糖剝奪后24 h時增加最多(P＜0.01)；與模型組相比，rhEPO預處理組LDH漏出率在5 h時長的氧糖剝奪后24 h時的增高趨勢有明顯降低(P＜0.01)，見表1。

2.4 RT-PCR法檢測 AQP4 mRNA的表達變化正常組星形膠質細胞有一定量的AQP4 mRNA表達；與正常組比較，模型組細胞AQP4 mRNA在5 h氧糖剝奪并復氧培養至0.5 h時表達有所下降(P ＝ 0.041)，2 h時回升(P ＝0.381)，至 8 h時明顯高于正常并達最高值(P＜0.01)，24 h時有所下降，但仍明顯高于正常水平(P＜0.01)；與模型組比較，rhEPO預處理組AQP4 mRNA在氧糖剝奪后的表達變化趨勢與模型組相似，但在各個時間點的表達水平均有明顯降低(8 h時：P＜0.001)，見圖 3，表2。

圖1 原代成熟的星形膠質細胞(A光學顯微鏡)及其鑒定(B細胞免疫熒光)

圖2 rhEPO預處理對5 h氧糖剝奪后星形膠質細胞形態的影響。

2.5 Western Blot法檢測AQP4蛋白的表達變化正常組星形膠質細胞有一定量的AQP4蛋白表達；與正常組相比，模型組細胞AQP4蛋白在5 h氧糖剝奪并復氧培養至 0.5 h時表達先下降(P＝0.021)，2 h 時回升(P ＝ 0.527)，至 8 h 時明顯高于正常組(P ＜ 0.01)，24 h 時達最高值(P ＜ 0.01)；rhEPO預處理組AQP4蛋白在5 h氧糖剝奪后的表達變化趨勢與模型組相似，但在各個時間點的表達水平均有明顯降低(24 h 時：P ＜ 0.01)，見圖3，表2。

3 討論

近二十年來，研究發現EPO及其受體廣泛存在于中樞神經系統中[10]，在病理條件下發揮了各種重要的神經保護功能。最新研究表明rhEPO可以明顯減輕大鼠顱腦創傷后的腦水腫[2]和大鼠凍傷模型中的血管源性腦水腫[11]，并且能夠很好地保護血腦屏障的完整性[12]。Gunnarson等在體外低滲模型及興奮性氨基酸模型中發現，rhEPO能明顯降低野生原代星形膠質細胞水通透性的上調，但在AQP4敲出的原代星形膠質細胞中則無上述作用[4]。目前，rhEPO減輕腦水腫的具體途徑及機制目前都尚不清楚。所以，本研究觀察rhEPO預處理后對體外星形膠質細胞水腫模型中AQP4表達的影響，探討EPO減輕腦水腫是否是通過調節AQP4的表達來實現的。

體外氧糖剝奪模型可引起星形膠質細胞胞體和突起明顯腫脹，能模擬體內顱腦創傷等神經系統疾病中星形膠質細胞因缺血再灌注損傷引起細胞毒性腦水腫這一重要病理過程。本實驗中，星形膠質細胞在5 h氧糖剝奪后，細胞逐漸腫脹，2 h至8 h時達到腫脹高峰，至24 h時腫脹仍未消退，期間有大量細胞壞死，LDH活性的不斷增高也印證了星形膠質細胞嚴重損傷的表現。而在氧糖剝奪前加入rhEPO預處理，能使細胞的腫脹明顯減輕，且在復氧后24 h時，腫脹的細胞形態已基本恢復正常，壞死細胞明顯減少，LDH活性增高的程度也同樣明顯降低。上述結果表明rhEPO預處理能夠明顯減輕5 h氧糖剝奪引起的星形膠質細胞水腫。

表1 rhEPO預處理對5 h氧糖剝奪后星形膠質細胞LDH漏出率的影響

圖3 rhEPO預處理對5 h氧糖剝奪后各時間點星形膠質細胞AQP4 mRNA和蛋白表達的影響

表2 rhEPO預處理對5 h氧糖剝奪后AQP4 mRNA和蛋白表達的影響

AQP4是腦內主要的水通道蛋白，在國內外研究及本課題組的前期研究當中發現，它與腦水腫的形成及轉歸均密切相關。Papadopoulos等人在細胞毒性腦水腫模型發現中，AQP4敲除小鼠的腦水腫程度明顯輕于野生小鼠[13]。Thrane等人發現AQP4敲除鼠可減輕低滲液引起的星形膠質細胞腫脹[14]。而Yang等人發現在過表達AQP4小鼠中，其細胞毒性腦水腫則較野生型小鼠更加嚴重[15]。由此可見，AQP4表達水平的高低與細胞毒性腦水腫的嚴重程度呈正相關。

在5 h氧糖剝奪后星形膠質細胞嚴重水腫的過程中，AQP4 mRNA和蛋白的表達量在短時下降后，呈上升趨勢。而在加入rhEPO預處理后，AQP4 mRNA和蛋白的表達在星形膠質細胞氧糖剝奪后各個時間點較模型組均明顯降低，細胞水腫也明顯減輕。AQP4在氧糖剝奪后短時下降可能是細胞保護性下調，或者因氧糖剝奪導致的細胞能量障礙，使其蛋白合成能力降低所致。而經rhEPO預處理后，氧糖剝奪后星形膠質細胞AQP4的表達水平明顯降低，由此可以阻止細胞水腫過程中胞外水分異常過多的進入細胞內，從而達到減輕5 h氧糖剝奪后星形膠質細胞水腫的作用。

EPO調節AQP4表達，減輕氧糖剝奪后星形膠質細胞水腫的作用，為臨床創傷性腦水腫、顱內瘤周腦水腫等腦水腫的治療提供了新的思路。最新研究表明，EPO可通過調節ERK信號通路的活化減輕創傷性腦水腫，起到神經系統保護的作用[16]，但其具體分子機制研究有待于我們進一步的研究來探討。

[1]Verdonck O，Lahrech H，Francony G，et al.Erythropoietin protects from post-traumatic edema in the rat brain[J].J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(7)：1369-1376.

[2]Liao ZB，Zhi XG，Shi QH，et al.Recombinant human erythropoietin administration protects cortical neurons from traumatic brain injury in rats [J].Eur J Neurol，2008，15(2)：140-149.

[3]朱紅燦，李紅戈，孫圣剛.短暫性前腦缺血沙土鼠腦內促紅細胞生成素的表達變化[J].中國神經精神疾病雜志，2004，30(3)：235-235.

[4]Gunnarson E，Song Y，Kowalewski JM，et al.Erythropoietin modulation of astrocyte water permeability as a component of neuroprotection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(5)：1602-1607.

[5]唐兆華，廖正步，蔣光元，等.水通道蛋白4在缺氧缺糖后水腫星形膠質細胞中的作用[J].第三軍醫大學學報，2010，32(13)：1387-1390.

[6]李靜，李長清.血紅蛋白致腦組織水腫機制研究[J].中國神經精神疾病雜志，2008，34(11)：684-686.

[7]Kimelberg HK. Astrocytic swelling in cerebral ischemia as a possible cause of injury and target for therapy[J].Glia，2005，50(4)：389-397.

[8]McCarthy KD，de Vellis J.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue[J].J Cell Biol，1980，85(3)：890-902.

[9]Panickar KS，Polansky MM，Anderson RA.Cinnamon polyphenols attenuate cell swelling and mitochondrial dysfunction following oxygen-glucose deprivation in glial cells[J].Exp Neurol，2009，216(2)：420-427.

[10]Genc S，Koroglu TF，Genc K.Erythropoietin and the nervous system[J].Brain Res，2004，1000(1-2)：19-31.

[11]Okutan O，Turkoglu OF，Gok HB，et al.Neuroprotective effect of erythropoietin after experimental cold injury-induced vasogenic brain edema in rats[J].Surg Neurol，2008，70(5)：498-502.

[12]Uzum G，Sarper Diler A，Bahcekapili N，et al.Erythropoietin prevents the increase in blood-brain barrier permeability during pentylentetrazol induced seizures[J].Life Sci，2006，78(22)：2571-2576.

[13]Papadopoulos MC，Verkman AS.Aquaporin-4 gene disruption in mice reduces brain swelling and mortality in pneumococcal meningitis[J].J Biol Chem，2005，280(14)：13906-13912.

[14]Thrane AS，Rappold PM，Fujita T，et al.Critical role of aquaporin-4(AQP4) in astrocytic Ca2+signaling events elicited by cerebral edema[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(2)：846-851.

[15]Fu X，Li Q，Feng Z，et al.The roles of aquaporin-4 in brain edema following neonatal hypoxia ischemia and reoxygenation in a cultured rat astrocyte model[J].Glia，2007，55(9)：935-941.

[16]Valable S，Francony G，Bouzat P，et al.The impact of erythropoietin on short-term changes in phosphorylation of brain protein kinases in a rat model of traumatic brain injury[J].J Cereb Blood Flow Metab，2010，30(2)：361-369.