宮頸疾病患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的檢測及臨床意義

袁冬蘭，錢華

（泰州市人民醫(yī)院婦產科，江蘇泰州225300）

宮頸疾病患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的檢測及臨床意義

袁冬蘭，錢華

（泰州市人民醫(yī)院婦產科，江蘇泰州225300）

目的檢測宮頸癌、宮頸上皮內瘤變患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達，分析其臨床意義。方法熒光抗體CD127-FITC、CD4-PECY5、CD25-PE標記T細胞，流式細胞術測定50例宮頸癌患者和49例宮頸上皮內瘤變患者中CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達。結果與正常對照組[n=33，(8.07±2.18)%]比較，宮頸癌組[n=50，(11.15±1.97)%]、宮頸上皮內瘤變組[n=49，(10.61±2.62)%]CD4+CD25+CD127-/low均顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001）；與宮頸上皮內瘤變Ⅰ級組[n=16，(8.96±0.65)%]比較，宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級組[n=33，(11.54±2.72)%]顯著升高，兩者比較有差異統(tǒng)計學意義（t=4.114，P＜0.001）；與宮頸癌Ⅰ期組[n=20，(10.34±1.79)%]比較，宮頸癌Ⅱ期組[n=30，(11.68±1.97)%]顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（t= 2.424，P＜0.05）。結論外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達升高可能在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發(fā)病的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用。

宮頸癌；宮頸上皮內瘤變；CD4+CD25+CD127-/lowTreg

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性腫瘤的第2位。全世界每年有20多萬女性死于宮頸癌。研究表明，腫瘤的發(fā)生與機體免疫逃避有關[1]，調節(jié)性T淋巴細胞(Treg)具有免疫無能性和免疫抑制性，是腫瘤免疫抑制的重要途徑之一。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫抑制特性的T淋巴細胞亞群，在外周免疫應答的調節(jié)中發(fā)揮重要作用[2]。該細胞亞群能夠抑制自身免疫病的發(fā)生，參與腫瘤免疫的調節(jié)。我們對宮頸癌和宮頸上皮內瘤變患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞進行研究，分析其在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產品，用CELLQuest軟件（BD公司）獲取和分析實驗數(shù)據。鞘液用Systmex公司的Cellpack血細胞稀釋液。

1.1.2 試劑CD4-PeCy5(Code No：MHCD0406)、CD25-PE(Code No：MHCD2504)及其同型對照Mouse IgG1-PE(Code No：MG104)由Invitrogen公司提供；CD127-FITC(Clone：Ebiordr5)和同型對照Mouse IgG1-FITC k Isotype Control(clone：P3)由eBioscience公司提供。

1.1.3 研究對象選取2010年1～12月在我院初診的宮頸癌患者50例(宮頸癌組)，年齡31～75歲，平均(50±7)歲；宮頸上皮內瘤變患者49例(宮頸上皮內瘤變組)，年齡28～54歲，平均(42±6)歲。另選擇我院健康體檢健康志愿者33例(正常對照組)，年齡25～58歲，平均(35±8)歲。

1.2 方法

1.2.1 標本準備受試者均于清晨空腹狀態(tài)下抽取外周靜脈血EDTA-K2抗凝2 ml，標本在6 h之內測定。

1.2.2 CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的測定將試管分為兩組，測定管加入CD4-PeCY5和CD25-PE各5μl、CD127-FITC 20μl，對照管加入CD4-PeCY5和Mouse IgG1-PE各5μl、Mouse IgG1-FITC 20μl；將標本充分混勻，分別加50 ml EDTA-K2抗凝血于上述兩組試管中，震蕩器上充分混勻，避光放置15 min；加入溶血素2 ml，充分震蕩，避光放置10 min。1 500 rpm離心5 min棄上清，加入生理鹽水2 ml震蕩，1 500 rpm離心5 min棄上清，加入生理鹽水100μl，充分震蕩混勻，待測。

1.2.3 流式細胞儀器設置及數(shù)據分析用FACSComp調整儀器FSC、SSC、FL1、FL2、FL3的電壓及補償。用CELLQuest軟件獲取20 000個淋巴細胞進行分析。選取CD4+細胞進行分析，分別以同型對照管調整Marker的位置。在同等的實驗條件下，用以分析測定管中CD4+CD25+CD127-/lowT細胞占CD4+T細胞的比例（見圖1）。

圖1 CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞測定圖

1.3 統(tǒng)計學處理采用sigmastat3.1軟件進行統(tǒng)計分析，文中正態(tài)分布數(shù)據以均數(shù)±標準差()表示。兩組樣本間正態(tài)分布采用t檢驗進行分析，多組樣本間采用One Way ANOVO的單因素方差分析進行檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸上皮內瘤變患者、宮頸癌患者及正常對照組外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞比較結果顯示，與正常對照組[n=33，(8.07±2.18)%]比較，宮頸癌組[n=50，(11.15±1.97)%]、宮頸上皮內瘤變組[n= 49，(10.61±2.62)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞均顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001）。而宮頸癌組和宮頸上皮內瘤變組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.161，P=0.249）。

2.2 宮頸上皮內瘤變患者不同分期患者組外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞比較結果顯示，與宮頸上皮內瘤變Ⅰ級組[n=16，(8.96±0.65)%]比較，宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級組[n=33，(11.54±2.72)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（t=4.114，P＜0.001）。

2.3 宮頸癌不同分期患者組外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞比較結果顯示，與宮頸癌Ⅰ期組[n=20，(10.34±1.79)%]比較，宮頸癌Ⅱ期組[n=30，(11.68±1.97)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（t=2.424，P＜0.05）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與人體的免疫功能密切相關，T淋巴細胞在其中起了尤其重要的作用[1]。Treg細胞是一類具有免疫抑制特性的T淋巴細胞亞群，在外周免疫應答的調節(jié)中發(fā)揮重要作用[2]。Treg細胞根據表面標志、分泌的細胞因子及發(fā)揮作用的方式，可分為多種亞群，主要包括CD4+CD25+天然Treg、Ⅰ型Treg (Tr1)及Th3。CD4+CD25+Treg起源于胸腺，并作為一個獨立的T細胞亞群在胸腺發(fā)育、分化和成熟。近年來CD4+CD25+Treg的分子標志也已逐漸被識別，其高水平表達IL-2αR(CD25)、CTLA-4、GITR、CIM4、CD45等分子，而低表達CD45RB分子[3]。最初選用高表達CD25（CD25hi）的細胞群作為對CD4+CD25+Treg的界定方法。這樣得到的Treg細胞不準確，因為經免疫激活的效應性T細胞CD25的表達也會上調，使之很難區(qū)分Treg細胞和效應性T細胞。轉錄因子FoxP3在天然Treg細胞發(fā)育及功能維持中發(fā)揮了關鍵的作用[4]。許多學者采用Foxp3轉錄因子作為Treg細胞內的特征性標志物[5]。但FoxP3為胞內蛋白，該方法需要固定、穿孔、染色，操作繁瑣，難以在臨床和科研中推廣。我們在前期研究顯示，CD4+CD25highCD127low亞群主要是表達FOXP3+的調節(jié)性T細胞(CD4+CD25high FOXP3+Treg)，CD4+CD25+CD127-/low細胞亞群與可以較準確反映CD4+CD25high FOXP3+Treg細胞的數(shù)量[6]。因此我們用CD4+CD25+CD127-/low的界定方法對宮頸癌、宮頸上皮內瘤變患者外周血細胞Treg進行定義分析。結果顯示：宮頸癌、宮頸上皮內瘤變患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均顯著高于正常對照人群，可能是CD4+CD25+CD127-/lowTreg升高使機體免疫系統(tǒng)受抑制，監(jiān)視體內突變細胞能力下降。提示CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達升高可能在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發(fā)病中起重要作用。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫監(jiān)視功能有非常密切的關系。機體的免疫調節(jié)功能不僅能抑制自身免疫性疾病發(fā)生，還可能參與腫瘤免疫的調節(jié)。腫瘤的免疫逃逸機制之一是Treg細胞對抗腫瘤免疫的抑制作用。目前許多研究顯示多種腫瘤患者外周血和腫瘤部位可發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量和比例增加[7-8]。我們對不同分期的宮頸癌、宮頸上皮內瘤變患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞進行分析顯示：宮頸上皮內瘤變Ⅰ級患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均顯著高于宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級患者。宮頸癌Ⅰ期患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均顯著高于宮頸癌Ⅱ期患者。提示CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞可能與宮頸癌、宮頸上皮內瘤變的分期、分級相關。說明外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達升高可能在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發(fā)病的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用。但其在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發(fā)病的療效觀察和預后評估中的作用如何還有待進一步研究。

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Detection of the expression of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in peripheral blood in patients with cervix diseases and its clinical significance.

YUAN Dong-lan,QIAN Hua.Department of Gynecology&Obstetrics,People's Hospital of Taizhou City,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in peripheral blood in patients with cervix cancer and cervical intraepithelial neoplasia(CIN),and to explore its clinical significance.Methods T cells were marked with fluorescence antibody CD127-FITC,CD4-PECY5,CD25-PE.The levels of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells were detected by flow cytometry in 50 patients with cervix cancer(group A),49 patients with CIN(group B),and 33 healthy individuals(the control group).ResultsCompared with the control group[(8.07±2.18)%],the levels of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in group A[(11.15±1.97)%]and group B[(10.61±2.62)%]were significantly higher(t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001).The level of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in patients with CIN of gradeⅡ～Ⅲ[n=33,(11.54±2.72)%]was significantly higher than that in patients with CIN of gradeⅠ[n=16,(8.96±0.65)%], with t=4.114 and P＜0.001.The level of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in patients with cervix cancer of stageⅡ[n=30, (11.68±1.97)%]was significantly higher than that of patients with cervix cancer of stageⅠ[n=20,(10.34±1.79)%], with t=2.424 and P＜0.05.ConclusionCD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in the peripheral blood might play an important role in the development and progression of cervix cancer and CIN.

Cervix cancer;Cervical intraepithelial neoplasia;CD4+CD25+CD127-/lowTreg

R446.61

A

1003—6350（2012）04—011—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.04.004

2011-09-06）

袁冬蘭（1973—），女，江蘇省泰州市人，副主任醫(yī)師，學士。