宮頸疾病患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的檢測及臨床意義

袁冬蘭，錢華

（泰州市人民醫院婦產科，江蘇泰州225300）

宮頸疾病患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的檢測及臨床意義

袁冬蘭，錢華

（泰州市人民醫院婦產科，江蘇泰州225300）

目的檢測宮頸癌、宮頸上皮內瘤變患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達，分析其臨床意義。方法熒光抗體CD127-FITC、CD4-PECY5、CD25-PE標記T細胞，流式細胞術測定50例宮頸癌患者和49例宮頸上皮內瘤變患者中CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達。結果與正常對照組[n=33，(8.07±2.18)%]比較，宮頸癌組[n=50，(11.15±1.97)%]、宮頸上皮內瘤變組[n=49，(10.61±2.62)%]CD4+CD25+CD127-/low均顯著升高，兩者比較差異有統計學意義（t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001）；與宮頸上皮內瘤變Ⅰ級組[n=16，(8.96±0.65)%]比較，宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級組[n=33，(11.54±2.72)%]顯著升高，兩者比較有差異統計學意義（t=4.114，P＜0.001）；與宮頸癌Ⅰ期組[n=20，(10.34±1.79)%]比較，宮頸癌Ⅱ期組[n=30，(11.68±1.97)%]顯著升高，兩者比較差異有統計學意義（t= 2.424，P＜0.05）。結論外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達升高可能在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發病的發生、發展過程中起一定作用。

宮頸癌；宮頸上皮內瘤變；CD4+CD25+CD127-/lowTreg

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，發病率位于女性腫瘤的第2位。全世界每年有20多萬女性死于宮頸癌。研究表明，腫瘤的發生與機體免疫逃避有關[1]，調節性T淋巴細胞(Treg)具有免疫無能性和免疫抑制性，是腫瘤免疫抑制的重要途徑之一。CD4+CD25+調節性T細胞(Regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫抑制特性的T淋巴細胞亞群，在外周免疫應答的調節中發揮重要作用[2]。該細胞亞群能夠抑制自身免疫病的發生，參與腫瘤免疫的調節。我們對宮頸癌和宮頸上皮內瘤變患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞進行研究，分析其在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產品，用CELLQuest軟件（BD公司）獲取和分析實驗數據。鞘液用Systmex公司的Cellpack血細胞稀釋液。

1.1.2 試劑CD4-PeCy5(Code No：MHCD0406)、CD25-PE(Code No：MHCD2504)及其同型對照Mouse IgG1-PE(Code No：MG104)由Invitrogen公司提供；CD127-FITC(Clone：Ebiordr5)和同型對照Mouse IgG1-FITC k Isotype Control(clone：P3)由eBioscience公司提供。

1.1.3 研究對象選取2010年1～12月在我院初診的宮頸癌患者50例(宮頸癌組)，年齡31～75歲，平均(50±7)歲；宮頸上皮內瘤變患者49例(宮頸上皮內瘤變組)，年齡28～54歲，平均(42±6)歲。另選擇我院健康體檢健康志愿者33例(正常對照組)，年齡25～58歲，平均(35±8)歲。

1.2 方法

1.2.1 標本準備受試者均于清晨空腹狀態下抽取外周靜脈血EDTA-K2抗凝2 ml，標本在6 h之內測定。

1.2.2 CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的測定將試管分為兩組，測定管加入CD4-PeCY5和CD25-PE各5μl、CD127-FITC 20μl，對照管加入CD4-PeCY5和Mouse IgG1-PE各5μl、Mouse IgG1-FITC 20μl；將標本充分混勻，分別加50 ml EDTA-K2抗凝血于上述兩組試管中，震蕩器上充分混勻，避光放置15 min；加入溶血素2 ml，充分震蕩，避光放置10 min。1 500 rpm離心5 min棄上清，加入生理鹽水2 ml震蕩，1 500 rpm離心5 min棄上清，加入生理鹽水100μl，充分震蕩混勻，待測。

1.2.3 流式細胞儀器設置及數據分析用FACSComp調整儀器FSC、SSC、FL1、FL2、FL3的電壓及補償。用CELLQuest軟件獲取20 000個淋巴細胞進行分析。選取CD4+細胞進行分析，分別以同型對照管調整Marker的位置。在同等的實驗條件下，用以分析測定管中CD4+CD25+CD127-/lowT細胞占CD4+T細胞的比例（見圖1）。

圖1 CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞測定圖

1.3 統計學處理采用sigmastat3.1軟件進行統計分析，文中正態分布數據以均數±標準差()表示。兩組樣本間正態分布采用t檢驗進行分析，多組樣本間采用One Way ANOVO的單因素方差分析進行檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸上皮內瘤變患者、宮頸癌患者及正常對照組外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞比較結果顯示，與正常對照組[n=33，(8.07±2.18)%]比較，宮頸癌組[n=50，(11.15±1.97)%]、宮頸上皮內瘤變組[n= 49，(10.61±2.62)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞均顯著升高，兩者比較差異有統計學意義（t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001）。而宮頸癌組和宮頸上皮內瘤變組比較差異無統計學意義（t=1.161，P=0.249）。

2.2 宮頸上皮內瘤變患者不同分期患者組外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞比較結果顯示，與宮頸上皮內瘤變Ⅰ級組[n=16，(8.96±0.65)%]比較，宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級組[n=33，(11.54±2.72)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg顯著升高，兩者比較差異有統計學意義（t=4.114，P＜0.001）。

2.3 宮頸癌不同分期患者組外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞比較結果顯示，與宮頸癌Ⅰ期組[n=20，(10.34±1.79)%]比較，宮頸癌Ⅱ期組[n=30，(11.68±1.97)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞顯著升高，兩者比較差異有統計學意義（t=2.424，P＜0.05）。

3 討論

腫瘤的發生、發展與人體的免疫功能密切相關，T淋巴細胞在其中起了尤其重要的作用[1]。Treg細胞是一類具有免疫抑制特性的T淋巴細胞亞群，在外周免疫應答的調節中發揮重要作用[2]。Treg細胞根據表面標志、分泌的細胞因子及發揮作用的方式，可分為多種亞群，主要包括CD4+CD25+天然Treg、Ⅰ型Treg (Tr1)及Th3。CD4+CD25+Treg起源于胸腺，并作為一個獨立的T細胞亞群在胸腺發育、分化和成熟。近年來CD4+CD25+Treg的分子標志也已逐漸被識別，其高水平表達IL-2αR(CD25)、CTLA-4、GITR、CIM4、CD45等分子，而低表達CD45RB分子[3]。最初選用高表達CD25（CD25hi）的細胞群作為對CD4+CD25+Treg的界定方法。這樣得到的Treg細胞不準確，因為經免疫激活的效應性T細胞CD25的表達也會上調，使之很難區分Treg細胞和效應性T細胞。轉錄因子FoxP3在天然Treg細胞發育及功能維持中發揮了關鍵的作用[4]。許多學者采用Foxp3轉錄因子作為Treg細胞內的特征性標志物[5]。但FoxP3為胞內蛋白，該方法需要固定、穿孔、染色，操作繁瑣，難以在臨床和科研中推廣。我們在前期研究顯示，CD4+CD25highCD127low亞群主要是表達FOXP3+的調節性T細胞(CD4+CD25high FOXP3+Treg)，CD4+CD25+CD127-/low細胞亞群與可以較準確反映CD4+CD25high FOXP3+Treg細胞的數量[6]。因此我們用CD4+CD25+CD127-/low的界定方法對宮頸癌、宮頸上皮內瘤變患者外周血細胞Treg進行定義分析。結果顯示：宮頸癌、宮頸上皮內瘤變患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均顯著高于正常對照人群，可能是CD4+CD25+CD127-/lowTreg升高使機體免疫系統受抑制，監視體內突變細胞能力下降。提示CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達升高可能在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發病中起重要作用。

惡性腫瘤的發生、發展與機體的免疫監視功能有非常密切的關系。機體的免疫調節功能不僅能抑制自身免疫性疾病發生，還可能參與腫瘤免疫的調節。腫瘤的免疫逃逸機制之一是Treg細胞對抗腫瘤免疫的抑制作用。目前許多研究顯示多種腫瘤患者外周血和腫瘤部位可發現CD4+CD25+Treg細胞數量和比例增加[7-8]。我們對不同分期的宮頸癌、宮頸上皮內瘤變患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞進行分析顯示：宮頸上皮內瘤變Ⅰ級患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均顯著高于宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級患者。宮頸癌Ⅰ期患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均顯著高于宮頸癌Ⅱ期患者。提示CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞可能與宮頸癌、宮頸上皮內瘤變的分期、分級相關。說明外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細胞的表達升高可能在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發病的發生、發展過程中起一定作用。但其在宮頸癌和宮頸上皮內瘤變發病的療效觀察和預后評估中的作用如何還有待進一步研究。

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Detection of the expression of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in peripheral blood in patients with cervix diseases and its clinical significance.

YUAN Dong-lan,QIAN Hua.Department of Gynecology&Obstetrics,People's Hospital of Taizhou City,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in peripheral blood in patients with cervix cancer and cervical intraepithelial neoplasia(CIN),and to explore its clinical significance.Methods T cells were marked with fluorescence antibody CD127-FITC,CD4-PECY5,CD25-PE.The levels of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells were detected by flow cytometry in 50 patients with cervix cancer(group A),49 patients with CIN(group B),and 33 healthy individuals(the control group).ResultsCompared with the control group[(8.07±2.18)%],the levels of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in group A[(11.15±1.97)%]and group B[(10.61±2.62)%]were significantly higher(t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001).The level of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in patients with CIN of gradeⅡ～Ⅲ[n=33,(11.54±2.72)%]was significantly higher than that in patients with CIN of gradeⅠ[n=16,(8.96±0.65)%], with t=4.114 and P＜0.001.The level of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in patients with cervix cancer of stageⅡ[n=30, (11.68±1.97)%]was significantly higher than that of patients with cervix cancer of stageⅠ[n=20,(10.34±1.79)%], with t=2.424 and P＜0.05.ConclusionCD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in the peripheral blood might play an important role in the development and progression of cervix cancer and CIN.

Cervix cancer;Cervical intraepithelial neoplasia;CD4+CD25+CD127-/lowTreg

R446.61

A

1003—6350（2012）04—011—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.04.004

2011-09-06）

袁冬蘭（1973—），女，江蘇省泰州市人，副主任醫師，學士。