不同品種丁香葉中蘆丁及丁香苦苷的含量測定

于淼1 孟繁穎1 蘇瑞2趙宏博1崔培珅1方洪壯1

（1佳木斯大學藥學院，黑龍江佳木斯154007；2哈爾濱市第一醫院藥劑科，黑龍江哈爾濱150010）

藥用丁香葉為木樨科丁香屬植物紫丁香（Syringa oblata Lindl.）、 朝 鮮 丁 香 （Syringa diatata Naka.）和洋丁香（Syringa vulgaris L.）的干燥葉[1]，具有廣譜抗菌、抗病毒等作用，主要用于治療腸炎、急性痢疾、黃疸型肝炎、乙型肝炎、結膜炎等[2-3]。常見的丁香屬植物還有暴馬丁香（Syringa reticulata（Blume）Hara.）、關東丁香（Syringa velutina Kom.）、小 葉 丁 香 （Syringa microphylla Diels.）、紅 丁 香（Syringa villosa Vahl.）和什錦丁香（Syringa chinensis Willd.）等。丁香屬植物中含有多種具有藥用活性的化學成分[4-5]，其中蘆丁具有清除自由基、抗脂質過氧化、舒張血管及影響藥物代謝酶活性等作用[6-7]；丁香苦苷具有清除氧自由基、抗菌消炎、抗病毒、降壓、降溫、鎮咳祛痰等作用[8]。為完善丁香葉藥材的質量控制，探索擴展丁香葉的藥用資源，本研究建立多波長同時測定丁香葉中蘆丁及丁香苦苷含量的高效液相色譜法（HPLC），并對7個品種丁香葉進行了含量測定。在定量色譜峰的確認上，采用化學計量學中的光譜相關色譜法[9-11]，處理丁香葉 HPLC-二極管陣列檢測器（DAD）的二維數據獲取準確的定性信息。結果表明，所建立的HPLC法可用于丁香葉中蘆丁及丁香苦苷的測定，方法準確可靠、靈敏度高；不同品種的丁香葉中都含有蘆丁，蘆丁及丁香苦苷含量在不同的丁香葉中均有較大的差異。

1 儀器與試藥

Agilent 1200系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），包括G1311A四元泵，G1322真空脫氣機，G1329自動進樣器，G1315DAD檢測器；BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）。

蘆丁對照品（天津一方科技有限公司，批號：20070824）；丁香苦苷對照品（上海順勃生物工程技術有限公司，批號：20091009）；丁香葉樣品為2010年7月采自哈爾濱植物園7種有分類標識的丁香樹的樹葉；流動相乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）及保護柱（4.6 mm ×12.5 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水（20∶80），流速 1.0 mL/min；定性分析時，檢測波長為200～400 nm，波長間隔2 nm；蘆丁定量分析檢測波長為255 nm，丁香苦苷225 nm；柱溫為室溫；進樣量10 μL；理論塔板數按蘆丁峰計算不少于6 000，丁香葉中蘆丁、丁香苦苷的色譜分離結果符合定量要求。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取經60℃減壓干燥的丁香葉粉末約1.0 g（過60目篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇 50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液。

2.2.2 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品和丁香苦苷對照品適量，精密稱定，分別用甲醇制成每1 mL含0.25 mg的蘆丁對照品儲備液和每1 mL含1.25 mg的丁香苦苷對照品儲備液。避光、冷藏。

2.3 色譜法定性

取供試品溶液及由蘆丁、丁香苦苷對照品溶液制得的混合對照品溶液，分別按2.1項定性條件進行測定。不同品種丁香葉與對照品的225 nm和255 nm HPLC圖見圖1。由圖1可知，蘆丁和丁香苦苷對照品色譜峰的保留時間分別為6和17 min。提取對照品色譜峰處的200～400 nm的數據，作為標準光譜，分別計算其與不同品種丁香葉色譜保留時間部分區間二維數據中的光譜間的相關系數，并繪制相應的光譜相關色譜曲線[10]，確定用于定量的色譜峰。其中，紫丁香葉和什錦丁香葉中蘆丁、丁香苦苷的光譜相關色譜曲線見圖2。

圖1 不同品種丁香葉中蘆?。?）、丁香苦苷（2）的255 nm 色譜圖（A）與 225 nm 色譜圖（B）

2.4 線性關系、檢測限和定量限

圖2 蘆丁、丁香苦苷的光譜相關色譜曲線

精密量取蘆丁、丁香苦苷對照品溶液各0.50、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置 10 mL 的不同量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，制成6個不同濃度的混合對照品溶液。按2.1項下定量色譜條件測定，每個濃度進樣2次，取其峰面積平均值Y為縱坐標，進樣量 X（μg）為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。蘆丁和丁香苦苷分別在0.125 0～2.000 μg 和 0.625 0 ～ 10.000 μg 的 范圍 內線 性關系良好，結果見表1。取蘆丁、丁香苦苷對照品溶液，用甲醇逐步稀釋成不同濃度的對照品溶液，分別進樣10 μL，取信噪比S/N=3時的濃度為最低檢測限，S/N=10時的濃度為最低定量限。蘆丁、丁香苦苷的最低檢測限和最低定量限見表1。

表1 丁香葉藥材中蘆丁、丁香苦苷的標準曲線、檢測限和定量限

2.5 精密度試驗

選取用于制備標準曲線中的3個不同濃度混合對照品溶液（含蘆丁濃度分別為0.05、0.10、0.15 mg/mL；含丁香苦苷濃度分別為 0.25、0.50、0.75 mg/mL）。每個濃度連續進樣 6次，記錄蘆丁和丁香苦苷色譜峰的峰面積值，以峰面積計算RSD（n=6）分別小于 0.49%、0.49%、0.48%和 0.42%、0.40%、0.41%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一份供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12、24 h進樣，記錄色譜峰面積。結果蘆丁峰面積的RSD為0.95%，丁香苦苷峰面積的RSD為0.35%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取紫丁香葉6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別在上述色譜條件下進行測定，記錄峰面積，計算含量。結果樣品中蘆丁的RSD為1.6%；丁香苦苷的RSD為2.1%，表明該方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

取已知含有量的紫丁香葉粉末9份，各約0.1 g，精密稱定，每3份為1組。每組按蘆丁和丁香苦苷含有量的 120%、100%、80%3個目標質量，分別精密加入適量的蘆丁和丁香苦苷的對照品溶液，按2.2項下方法平行制備成高、中、低3個濃度的供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，計算回收率。蘆丁和丁香苦苷的平均回收率分別為99.9%和99.4%，RSD分別為1.4%和1.1%。

2.9 樣品含量測定

取不同品種丁香葉粉末各3份，每份1 g，精密稱定，按 2.2項下方法制成供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，用外標法測定計算蘆丁和丁香苦苷的含量。結果見表2。

表2 不同品種丁香葉中蘆丁和丁香苦苷的含量（mg/g，n=3）

由表2可知，7種丁香葉中蘆丁和丁香苦苷的含有量均差異較大，其中，丁香苦苷的差別更為明顯。7種丁香葉中均含有蘆丁，以洋丁香、小葉丁香和什錦丁香的含量較高；丁香苦苷在紫丁香葉中含量最高，且在小葉丁香、關東丁香、暴馬丁香和紅丁香中未檢測到。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇上，比較了等度洗脫條件下的不同比例的甲醇-磷酸水、甲醇-乙腈-磷酸水及乙腈-磷酸水體系，結果以乙腈-磷酸水分離效果最佳；也比較了0.1%、0.2%和0.3%3個不同濃度的磷酸水，結果未見磷酸的濃度對分離結果有影響，故最終選定流動相為乙腈-0.1%磷酸水（20∶80）。另外，對供試品溶液及對照品溶液的蘆丁和丁香苦苷色譜峰DAD檢測結果表明，蘆丁與丁香苦苷的紫外光譜的最大吸收分別為255 nm和225 nm。為增加方法的靈敏度，采用了多波長同時檢測方法[12]，在255 nm測定蘆丁，在225 nm測定丁香苦苷。

3.2 供試品溶液制備時，當提取溶液量（50 mL）不變，丁香葉粉末量分別為 0.1、0.5、1.0 g時，樣品的提取率不受影響?；诖私Y果，回收率試驗時，選用的樣品量為0.1g而非通常的樣品測定時的1/2量（0.5 g），以節省對照品的加入量。

3.3 丁香苦苷作為丁香葉藥材的主要有效物質的文獻報道較多，而未見丁香葉中蘆丁含量測定的報道。本實驗中曾對山梅花屬植物西南丁香葉進行了測定，西南丁香葉中也含有蘆丁，且含有量高于實驗所涉及的7種丁香屬植物。

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