銀杏葉總黃酮對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

王遠1 王海桃2

（1青島市第九人民醫院，山東 青島 266002；2青島市腫瘤醫院，266042）

腦 梗 死 （cerebral infarction，CI）[1]又 稱 缺 血 性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS），是指局部腦組織因血液循環障礙，缺血、缺氧而發生的軟化壞死。CI主要是由于供應腦部血液的動脈出現粥樣硬化和血栓形成，使管腔狹窄甚至閉塞，導致局灶性急性腦供血不足而發病。CI具有發病率高、致殘率高、預后差、易復發等特點，居腦血管病死亡原因之首。再灌注損傷可以使復流腦組織神經細胞壞死或凋亡加重，水腫明顯，梗死面積擴大，并繼發血管內皮細胞損傷及植物神經功能障礙。

銀杏葉味甘、苦、澀，性平，有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛功效。銀杏葉總黃酮是一種天然中草藥提取物，其中含有黃酮類、萜內酯類、少量的多酚類、生物堿、長鏈醇、酮類及微量元素等主要化學成分，其中銀杏黃酮、銀杏內酯類物質有拮抗血小板活化因子、抑制血小板聚集、擴張血管等作用[2]。本研究就銀杏葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其可能的作用機制進行了研究，為銀杏葉總黃酮在治療CI的醫藥領域提供理論依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

S-54紫外可見光分光光度計（上海棱光技術有限公司）；HH-SY11-Ni電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表有限公司）；GL-203Ⅱ離心機（上海安亭科學儀器廠）；XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；光學顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 材料和試劑

昆明種小鼠（泰山醫學院實驗動物中心提供），雌性，15～ 25 g；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成科技有限公司）；舒血寧注射液（國藥準字Z11021351，北京雙鶴高科天然藥物有限責任公司）。

2 實驗方法與結果

2.1 實驗方法

2.1.1 動物分組與給藥

小鼠隨機分為5組，即對照組、模型組、銀杏葉總黃酮高劑量組（20 mg/kg）、銀杏葉總黃酮中劑量組（5 mg/kg）、銀杏葉總黃酮低劑量組（1 mg/kg），每組8只。小鼠適應性喂養3 d后，銀杏葉總黃酮注射液腹腔注射連續給藥7 d。模型組和對照組在相同時間注射等量生理鹽水。末次給藥2 h后進行腦缺血再灌注手術。術后繼續給藥，48 h后取血測定SOD、MDA，取腦組織切片做蘇木素-伊紅（HE）染色。

2.1.2 動物模型的制備[3]

動物于術前12 h禁食，稱重，按0.1 mL/10 g腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉麻醉。用醫用膠帶仰臥位固定小鼠，行頸部正中切口，分離雙側頸總動脈及伴行的迷走神經，從分離好的頸總動脈下方穿過一條絲線，將絲線提起，掛于鐵架臺上阻斷血流，15 min后松線恢復腦血液循環，10 min后實行再灌注，重復3次，縫合頸部皮膚。術后將小鼠置于37℃恒溫環境促其蘇醒。術后及時供應水分及飼料。對照組僅分離雙側頸總動脈及伴行的迷走神經。

2.1.3 形態學指標測定

小鼠手術后48 h斷頭取腦，將腦組織固定在40%中性甲醛48 h后，流動水沖洗24 h，梯度酒精脫水，按常規方法進行石蠟包埋，切片依次入二甲苯脫蠟、梯度酒精復水，雙蒸水洗2次，蘇木精染色 8 min，1%鹽酸酒精分色，堿性水藍化，伊紅10 min復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并照相。

2.1.4 血清指標測定

小鼠術后48 h摘眼球取血于1.5 mL離心管中，4℃靜置 24 h，3 000 r/min 離心 10 min，取上清按照各試劑盒說明書進行血清中SOD、MDA含量測定。

2.1.5 統計學處理

2.2 實驗結果

2.2.1 銀杏葉總黃酮對小鼠腦神經形態的影響

小鼠腦皮層區及海馬區HE染色結果如圖1、2所示：對照組腦神經細胞呈橢圓形，排列整齊，結構正常，核染色質稀疏，核仁清楚；模型組腦神經細胞數量明顯下降，變性細胞數明顯增多，可見許多神經細胞出現明顯形狀上的改變，細胞排列紊亂，結構模糊，細胞間隙增大，細胞體積縮小，胞漿濃縮，染色質凝集；與模型組相比，中劑量組明顯減輕了神經細胞的變性。

2.2.2 銀杏葉總黃酮對小鼠血清SOD、MDA的影響

圖1 小鼠腦組織皮層區HE染色結果（×400）

圖2 小鼠腦組織海馬區HE染色結果

與對照組相比，模型組小鼠血清中的SOD活性下降，MDA含量增加；與模型組相比，銀杏葉總黃酮則使小鼠血清中的SOD活性增強，并使MDA含量下降（見表1）。

表1 銀杏葉總黃酮對小鼠血清中SOD和MDA影響（n=8，±s）

表1 銀杏葉總黃酮對小鼠血清中SOD和MDA影響（n=8，±s）

注：*用藥組與模型組比較，P＜0.05；Δ模型組與對照組比較，P＜0.05；**用藥組與模型組比較，P＜0.01；Δ Δ模型組與對照組比較，P＜0.01

組別 劑量（mg/kg）SOD（U/mL）MDA（U/10mL）對照組 - 193.00±9.10 38.6±28.5模型組 - 166.98±20.87Δ 120.0±17.3ΔΔ低劑量組 1 167.66±26.33 96.2±14.8**中劑量組 5 196.23±19.68* 83.6±16.4**高劑量組 20 198.71±20.20* 68.4±15.2**

3 討論

銀杏是地球上存活最久的植物之一，銀杏葉始載于《本草品匯精要》，作為祖國的傳統中藥已沿用數千年。銀杏葉總黃酮具有廣泛的生理活性，在中樞神經系統中具有調節腦能量代謝、保護神經元、增強記憶等功能。由于銀杏葉的有效成分已基本確認，近年來出現了一些關于銀杏葉的臨床藥理學及應用研究。

本實驗通過對小鼠腦組織進行HE染色，研究發現腦缺血灌注的小鼠較正常小鼠相比，腦神經細胞數量明顯下降，細胞結構破壞明顯，而經銀杏葉總黃酮預處理后，可以明顯減輕腦神經細胞的受損程度，改善小鼠的CI情況，表明銀杏葉總黃酮對CI具有一定的保護作用。

缺血性腦損傷是多種病理機制交互作用的結果[4]，在諸多損傷因素中，神經細胞能量衰竭被認為是首先發生的重要環節，腦組織缺血后能量代謝的異常，使線粒體內電子傳遞失調，致使氧分子接受單個電子生成氧自由基，同時黃嘌呤氧化酶（XO）系統被激活，XO在將三磷酸腺苷（ATP）的降解產物次黃嘌呤轉化為黃嘌呤，并產生大量氧自由基，另外SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等自由基清除系統被大量消耗也造成缺血后腦組織自由基的堆積。自由基損傷的主要病理機制是腦缺血再灌注后，由于腦組織中富含脂質，極易受到氧自由基的攻擊，膜脂質發生過氧化，破壞了膜脂質的代謝和結構，并生成了一系列脂質自由基及其降解產物MDA[5]。自由基也可直接氧化酶蛋白氨基酸殘基，引起酶蛋白構象改變，使酶失活。

正常生物體內自由基生成與清除處于動態平衡[6]，腦缺血時，氧供應不足，大量的自由基生成，使腦內脂質過氧化作用加強，導致細胞及細胞屏障損害，神經元壞死或凋亡，引起和加重缺血腦組織水腫。再灌注恢復組織氧供應，也提供了大量電子受體，使氧自由基在短時間內爆發性增多。SOD為抗氧化酶，是體內主要的自由基清除劑，能催化超氧自由基發生歧化反應，清除體內超氧自由基，對維護細胞結構和功能完整，延緩細胞衰老發揮重要作用[7]。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，其活性可以間接反映機體清除自由基的能力，因此，可將SOD活性大小作為機體抗氧化能力的一項重要指標。本研究結果表明，腦缺血再灌注可使小鼠血清中SOD活性降低，而給予銀杏葉總黃酮預處理后，可減輕這種損傷，提高血清中SOD活性[8]。

機體通過酶系統與非酶系統產生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，并因此形成脂質過氧化物[9]，如醛基（如MDA）、酮基、羥基、氫過氧基等。脂質過氧化作用不僅把活性氧轉化為活性化學劑，即非自由基性的脂類分解產物，而且可通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大活性氧的作用。因而測定MDA的量常?？煞从硻C體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度[10]。本研究結果表明，腦缺血再灌注可使小鼠血清中MDA含量升高，給予銀杏葉總黃酮預處理后，可減輕腦缺血再灌注引起的損傷，降低MDA含量。

[1]韓德新.腦梗死治療的中醫藥研究進展[J].內蒙古中醫藥，2009，（6）：73-74.

[2]廖標武.銀杏葉提取物對腦缺血再灌注大鼠保護作用的研究[J].中國醫院藥學雜志，2007，27（12）：1705-1707.

[3]馬叢，王蕾.小鼠腦缺血再灌注模型方法及中藥的藥理作用[J].中華中醫藥學刊，2008，26（2）：280-282.

[4]楊佳丹，董志.腦缺血再灌注損傷的病因學研究進展[J].中國康復醫學雜志，2006，21（10）：935-938.

[5]譚婷，陳鵬，王美納.腦缺血再灌注損傷機制研究進展[J].中國行為醫學科學，2005，20（3）：144-146.

[6]馬作峰，姜瑞雪，張六通，等.固本健腦法對老年健忘模型動物大腦皮層Na+-K+-ATP酶、血清SOD活性和MDA含量的影響[J].中華中醫藥學刊，2011，29 （12）：2702-2704.

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[9]劉穎，陳鎮，葛朝亮，等.燒傷膏對燙傷小鼠皮膚細胞自由基代謝和 DNA 損傷的影響[J].中國執業藥師，2011，8（9）：25-34.

[10]喬玉成.老齡大鼠腦組織SOD/MDA與NO/NOS的相關性研究[J].中國體育科技，2009，45（2）：102-106.