熊果酸對二乙基亞硝胺誘發(fā)小鼠肝癌前病變的防護作用*

毛文超 宋藝君 張 健 焦藝博 馮麗莉 白薈芳 王秀萍 蔡大勇 王玥琦

1.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 (北京，100029) 2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所

筆者觀察熊果酸和熊果酸聯(lián)合枸杞子對二乙基亞硝胺誘導的小鼠肝癌前病變的防護作用，對比此兩種用藥方法的療效，為臨床聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 實驗動物：昆明種小鼠，雄性，體重20～22g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號 SCXK-京-2006-0009。藥品試劑：①二乙基亞硝胺(DEN)：0.95g/ml，批號：078K1635，美國Sigma公司產(chǎn)品。99 ml生理鹽水加1ml DEN振蕩混勻為1% 的DEN溶液 (4℃保存)。②熊果酸：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn) (純度90.012%)，加蒸餾水配制成濃度為15mg/ml的熊果酸藥液。③枸杞子水煎液：枸杞子購于北京圣惠堂中藥飲片有限公司(批號：090422)，稱取枸杞子67.8g，加10倍水煮沸后，文火煎煮30分鐘，煎煮兩次，3層紗布過濾，收集濾液濃縮至370ml，即濃度為0.18g/ml的枸杞子水煎液，4℃儲存?zhèn)溆谩＂芨喂δ茉噭┖校喊ū彼徂D氨酶 (ALT)、天冬氨酸轉氨酶 (AST)、堿性磷酸酶 (ALP)、谷胱甘肽S-轉移酶 (GST)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所 (批號：20100205)。主要儀器：Multiskan MK3酶標儀 (上海熱電儀器有限公司產(chǎn)品)，AL104-IC型精密電子天平 (上海梅特勒托利多儀器有限公司)，LG16-W型臺式高速離心機 (北京京立離心機有限公司)，電子恒溫水浴箱 (北京長風儀器儀表公司)，定量移液器 (上海大龍醫(yī)療設備有限公司)，德國LETIZ公司FS/FAS 5030石蠟切片機，日本濱松Nano Zoomer Digital Pathology數(shù)字病理掃描系統(tǒng)等病理科常規(guī)設備。Image-Pro Plus 7.0 morphometric analysis system(版本 7.0.1，序列號41N70000-60555，Media Cybernetics，USA)，JJ1000型電子分析天平 (美國雙杰兄弟集團有限公司常熟雙杰測試儀器廠)。

1.2 動物分組處理 40只小鼠體重均衡隨機分為4組，即正常組、模型組、熊果酸組、聯(lián)合用藥組。腹腔注射及灌胃劑量均按小鼠體重計。正常組小鼠每周1次 (周六12am)行腹腔注射生理鹽水 0.1ml/10g，連續(xù) 10次;同時 1次/d，(8am)灌胃生理鹽水0.1ml/10g，連續(xù)10周。模型組小鼠每周1次 (周六12am)行腹腔注射1%DEN溶液0.1ml/10g，連續(xù)10次，復制小鼠肝癌前病變模型。熊果酸組小鼠，造模型方法同模型組，同時1次/d(8am)灌胃熊果酸 (4.5mg/20g)藥液0.1ml/10g，共10周。聯(lián)合用藥組小鼠造模同模型組，同時1次/d，(8am)灌胃熊果酸藥0.1ml/10g，每天4pm灌胃枸杞子 (12mg/10g)水煎液0.1ml/10g，連續(xù)10周。

1.3 觀察指標檢測 ①一般狀況：實驗過程中每日觀察記錄小鼠進食狀況、體重、活動情況及外表征象。②肝功能變化：第10周時，小鼠禁食12小時后稱量體重 (Wb)，眼球后靜脈取血0.5ml，全血離心 (1 500rpm×10min)，血清-80℃保存。按試劑盒說明書測定ALT、AST、GST、ALP活性。③肝臟系數(shù)：小鼠取血后脫臼處死，沿腹正中線切口進腹腔，切取全部肝臟，生理鹽水清洗血跡，濾紙吸干生理鹽水，稱重肝臟質量 (Wl)，結合體重計算肝臟系數(shù) (Wb÷Wl×100%)。④病理變化：切取肝臟右葉，10ml 10%甲醛溶液固定48小時，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片;同步烤片與脫蠟，梯度酒精水化，HE染色。20倍物鏡和光鏡觀察質控蘇木素分化時間 (4秒最清晰)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片;光鏡下胞漿紅染，核藍染。按標準操作規(guī)范，使用Olympus顯微鏡20倍物鏡下隨機攝拍肝細胞團顯微照片5張，由病理醫(yī)師閱片、診斷和評價，確定肝損傷病變性質和病變程度。⑤形態(tài)計量：由于肝細胞水腫與增生肝細胞核異型性兩類病變分布均一，并且程度類似，符合形態(tài)計量的基本技術要求。20倍HE染色顯微照片，Image-Pro Plus顯微分析系統(tǒng)，形態(tài)計量肝索面積構成比和增生肝細胞核面積構成比。每只動物5張20倍顯微照片的平均數(shù)為1個統(tǒng)計數(shù)據(jù)。再以正常組與模型組平均數(shù)值，轉化原始數(shù)據(jù)為效能單位X=(Xi-Mcontrol) /(Mmodel-Mcontrol)，作矩形圖顯示用藥防護程度。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的一般狀態(tài) 正常組小鼠活潑好動，反應靈活，皮毛光澤，體重逐漸增加，無死亡;模型組小鼠精神萎靡，行動遲緩，食欲不振，皮毛枯槁、無光澤，體重先增加后降低，死亡1只;熊果酸組和聯(lián)合用藥組小鼠癥狀改善，活動度和食量比模型組小鼠增加，精神尚可。

2.2 各組小鼠體重與肝系數(shù) 見表1。

表1 各組小鼠體重與肝系數(shù)比較(±s)

表1 各組小鼠體重與肝系數(shù)比較(±s)

與正常組比較，a P ＜0.05，aa P ＜0.01; 與模型組比較，b P ＜0.05，bb P ＜0.01;與熊果酸組比較，c P ＜0.05，cc P ＜0.01

組別 用藥劑量(mg/kg)體重(g)肝臟重量(g)肝臟系數(shù)(%)正常組- 39.865 ±3.725 1.429 ±0.175 52.6223 ±1.9856模型組 - 29.50 ±4.84aa 1.124 ±0.246a 50.4783±3.2354a熊果酸組 225 30.29±1.601b 1.205±0.124b 51.5632 ±3.0297b聯(lián)合用藥組 112.5+1200 32.06 ±1.544bbc 1.352 ±0.069c 53.1209 ±1.4863c

2.3 各組小鼠血清肝功能情況 見表2。

表2 各組小鼠血清肝功能比較(±s，U/L)

表2 各組小鼠血清肝功能比較(±s，U/L)

與正常組比較，a P＜0.05，aa P ＜0.01; 與模型組比較，b P ＜0.05，bb P ＜0.01;與熊果酸組比較，c P ＜0.05，cc P ＜0.01

組別ALT AST GST ALP正常組21.87 ±4.964 14.783 ±2.061 13.504 ±2.481 5.093 ±1.640模型組225.07 ±85.811aa 52.205 ±14.083aa 42.308 ±13.685a 25.141 ±3.638aa熊果酸組68.04 ±14.400bb 25.118 ±2.776bb 21.721 ±4.726bb 19.937 ±5.259b聯(lián)合用藥組63.73 ±27.407bbc 24.835 ±5.411bbc 18.590 ±3.81bc 22.525 ±5.101

2.4 各組小鼠肝臟病理情況 正常組小鼠肝臟結構正常，有肝小葉和匯管區(qū) (見插頁圖1A)。肝小葉為規(guī)則肝細胞團;肝細胞索以中央靜脈為中軸，單行呈放射狀排列;相鄰肝板吻合連接成網(wǎng)狀，延伸到肝小葉周邊的界板。肝細胞為多面體形，肝細胞核圓，位于細胞中央，染色質稀疏，著色較淺，核膜清楚，有1～2個核仁。肝細胞索之間為肝血竇，有內(nèi)皮與枯否氏細胞;匯管區(qū)：小葉之間的區(qū)域，有肝動脈、門靜脈、膽管和少量結締組織，無顯著變性與壞死，無水腫、出血與浸潤。

模型組小鼠肝臟以肝細胞發(fā)生變質與增生為主要病變(見插頁圖1B)，包括細胞水腫與溶解壞死。肝細胞體積增大，胞漿淡染，胞漿內(nèi)水含量增加。肝細胞壞死發(fā)生在肝小葉內(nèi)、累積1個或幾個肝細胞的點狀壞死，未累及肝小葉界板的破壞;壞死灶原有肝細胞消失，代以浸潤的淋巴細胞或漿細胞;累及肝小葉界板的點狀壞死為碎片狀壞死。累積十幾個或幾十個肝細胞的帶狀壞死，不累及肝小葉界板的破壞;壞死灶原有肝細胞消失，網(wǎng)狀纖維塌陷代以膠原纖維。累及肝小葉界板的帶狀壞死為橋接壞死。肝細胞增生：細胞漿嗜堿性染色，可有雙核。增生肝細胞具有癌細胞樣異型性，表現(xiàn)為細胞體積大，且大小不一致;細胞核的體積大、染色深與形態(tài)怪異，核仁數(shù)量多、體積大，甚至出現(xiàn)核內(nèi)包涵體;顆粒狀藍染胞漿，分布不均勻。匯管區(qū)可找到膽管增生和淋巴細胞浸潤。

熊果酸組小鼠肝臟病變性質與模型組類似，程度減輕(見插頁圖1C)。增生細胞異型性較模型組減輕。溶解壞死很少累及肝小葉界板。匯管區(qū)有少量膽管增生和淋巴細胞浸潤。

聯(lián)合用藥組小鼠肝臟病變性質與模型組類似，程度減輕顯著 (見插頁圖1D)。病變緩解，中央靜脈明顯，肝索放射狀排列，肝細胞異型性小，雙核細胞少見。匯管區(qū)有極少量淋巴細胞浸潤。

2.5 4 組小鼠肝臟的病變程度 見圖2。形態(tài)計量數(shù)據(jù)分析見表3。結果顯示：與正常組比較，造模各組肝索構成比、核構成比顯著增加 (P＜0.01)，匯管區(qū)構成比增加 (P＜0.05);與模型組比較，熊果酸組防治有效 (P＜0.05);聯(lián)合用藥組療效優(yōu)于熊果酸組 (P＜0.01)。效能單位轉化 (圖2)顯示，熊果酸對肝癌前病變有預防作用 (P＜0.05)，熊果酸與枸杞子聯(lián)合用藥的預防作用強于單用熊果酸 (P＜0.01)。

圖24 組小鼠肝臟病變程度的效能趨勢(xˉ±s，ni=8)

表34 組小鼠的肝臟病變比較(±s，ni=8)

表34 組小鼠的肝臟病變比較(±s，ni=8)

與正常組比較，a P＜0.05，aa P ＜0.01; 與模型組比較，b P ＜0.05，bb P ＜0.01;與熊果酸組比較，c P ＜0.05，cc P ＜0.01

組別 匯管區(qū)構成比(v/v)肝索構成比(v/v)核構成比(v/v)正常組0.0086 ±0.0015 0.5141 ±0.0504 0.0143 ±0.0038模型組0.0435 ±0.0025a 0.7269 ±0.0166aa 0.0650 ±0.0035aa熊果酸組0.0301 ±0.0036b 0.6351 ±0.0235b 0.0481 ±0.0113bb聯(lián)合用藥組0.0182 ±0.0025bbcc 0.5847 ±0.0150bbc 0.0274 ±0.0074bbcc

3 討論

肝癌危害大［1］，在我國尤為明顯［2］，仍無有效防治辦法［3］。探索傳統(tǒng)中藥預防肝癌發(fā)病，有可能確定有效物質［4］。按中醫(yī)藥理論，夏枯草、女貞子、山楂等含熊果酸的中藥大多歸肝經(jīng)，具有清肝火、散郁結、清熱解毒等功效，為證候特征依賴性肝癌預防類中藥，具有護肝、降脂、調節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學活性［5，6］。大量研究表明熊果酸能通過多種機制誘導多種腫瘤細胞凋亡：①熊果酸對腫瘤的化學預防作用;②熊果酸的細胞毒活性;③熊果酸誘導腫瘤細胞凋亡作用;④腫瘤逆轉作用及抗侵襲性;⑤抑制腫瘤血管形成［7，8］。小鼠具有可基因干預發(fā)現(xiàn)靶點的優(yōu)勢，二乙基亞硝胺誘發(fā)小鼠肝癌前病變模型被用于研究預防肝癌藥物篩選［9］。肝癌前病變往往與肝腎證候同患，熊果酸與枸杞子配伍成臨床方劑，預防肝癌前病變［4］。本研究以二乙基亞硝胺誘發(fā)肝癌前病變［10］的小鼠為研究對象，以臨床等效劑量的熊果酸或配伍枸杞子水提物［11］灌胃進行預防，觀察小鼠體重、肝臟系數(shù)、肝功能損害、病理變化及其形態(tài)計量［12］，確定熊果酸對肝癌前病變的防治效應。

本實驗結果表明熊果酸對肝癌前病變具有預防作用，與枸杞子聯(lián)用預防效果增強。突出表現(xiàn)在小鼠體重回升、肝系數(shù)恢復、肝功能異常緩解、增生肝細胞異型性減小，形態(tài)計量上降低核異型性顯著。

二乙基亞硝胺損害生物分子，引起致癌與抑癌功能失衡，肝細胞獲得遺傳性增殖能力，導致肝癌發(fā)生是一個漸變過程［13］。在預防癌癥同類候選藥中，熊果酸抗癌優(yōu)勢在于作用廣譜，主要表現(xiàn)為抗致癌，抗促癌［14］。枸杞子可以增強H22荷瘤小鼠脾臟中以樹突狀細胞 (DC)為主的抗原遞呈細胞的功能，提示其抗腫瘤免疫作用機制可能與此有關［15］。但與熊果酸聯(lián)合用藥協(xié)同預防肝癌前病變的機制還有待研究。

本研究確定熊果酸抑制誘導性肝癌前病變進展，且與枸杞子聯(lián)用效應增強。既探索了天然藥物預防肝癌的研究思路，也提供中醫(yī)臨床處方用藥的實驗依據(jù)。

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