基于復雜網絡節點度分析技術的肝纖維化證候相關生物指標文獻研究*

王偉明 盧 朋 陳建新 趙 云 暢洪昇 王 偉△

1.北京中醫藥大學 (北京，100029) 2.中國科學院自動化研究所綜合信息系統研究中心 3.北京中醫藥大學信息中心4.軍事醫學科學院基礎醫學研究所

復雜網絡分析：復雜網絡是描述復雜系統的一種有效方式，對復雜網絡的分析有多種方法，本技術主要使用節點度來衡量生物指標的關聯性，確定關鍵的生物指標。所謂節點度是指該節點的連接數，即節點的邊數。在本文中，節點度表示為生物指標相關性。本技術使用復雜網絡描述相互關聯的生物指標，以3 018篇肝纖維化中醫證候醫學文獻為處理對象，從系統的、整體的、全局的觀點去考量生物指標，把生物指標作為實體對象，建立生物指標的復雜網絡，通過使用文本挖掘的同現處理、復雜網絡分析，獲取關鍵核心的生物指標。

1 資料與方法

1.1 檢索文獻與建立數據庫

1.1.1 依據2011年肝硬化中西醫結合診治共識［1］，確定肝硬化中醫證候：肝氣郁結證/水濕內阻證/濕熱蘊結證/肝腎陰虛證/脾腎陽虛證/瘀血阻絡證，以此作為文獻研究對象。

1.1.2 在CNKI(《中國知網》)基本檢索窗口中確定“全文”，分別輸入：“肝纖維化”和“肝硬化”，“并含”“主題”“證候or證”：分別得到文獻，肝氣郁結428篇，濕熱蘊結326篇，水濕內阻44篇，肝腎陰虛1 333篇，脾腎陽虛818篇，瘀血阻絡522篇，文獻發表時間：1981-2012年，共有文獻3 471篇，分別下載文獻。

1.1.3 納入標準 凡涉及到肝硬化 (或肝纖維化)中醫證候或某一證型與生物指標的相關研究文獻均列為納入文獻。

1.1.4 排除標準 ①非肝硬化或肝纖維化為主要內容的相關文獻予以排除;②綜述性文章均予以排除;③經閱讀發現內容重復且為同一研究的文獻，選擇資料最為完整的一篇文獻予以納入，其余排除;④僅有治療經驗而無相關生物理化指標的醫案及治驗性質的文章予以排除。

1.1.5 篩選策略及錄入方法 對以上檢索到的3 471篇文獻，進行人工核對和閱讀，按照上述納入與排除標準，篩選以肝硬化 (或肝纖維化)證候及相關生物指標為主要研究內容的文獻且為核心期刊收錄的文章3 018篇。對篩選文獻的基本信息進行整理，文章題目、中醫證候、生物指標、結論、文獻來源、作者、期刊等，并轉化至文本文檔錄入，建立數據庫。

2)改變超聲溫度313、323、333、343、353 K，超聲酸化后樣品編號記為ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

1.2 建立待選的生物指標詞典 按照肝臟疾病臨床與基礎的類別與范圍，先廣泛初選相關指標200個生物指標如下［2～7］：

神經內分泌指標(NEI)：多巴胺 (DA)，去甲腎上腺素(NE，NA)，乙酰膽堿 (Ach)，5-羥色胺 (5-HT)，促腎上腺皮質激素釋放激素 (CRH)，腎上腺素 (AD)，促腎上腺皮質激素 (ACTH)，性激素結合球蛋白 (SHBG)，血漿皮質酮(CORT)，血清睪酮 (T)，脫氧異雄酮，雄烷二酮 (AR)，雌二醇 (Ez)，雌酮 (EO)，雌三醇 (E)a，性激素結合球蛋白 (SHBG)，雌激素受體 (ER)，γ干擾素 (interferon γ，IFNr)。

肝纖維化指標：透明質酸 (HA)、層粘連蛋白 (LN)、Ⅲ型前膠原 (PCⅢ)、Ⅳ型膠原 (Ⅳ-C)，TP，CG，PLD，組織型纖溶酶原激活物 (PA)，組織型纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1。

肝炎肝硬化指標：HBV DNA定量，HCV RNA，凝血酶原活動度 (PTA)，丙氨酸氨基轉移酶 (ALT)，天冬氨酸轉氨酶 (AST)，總膽紅素 (TBil)，IFNα，IFNγ，白蛋白 (A)，球蛋白 (G)，白蛋白/球蛋白比值 (A/G)，血清膽堿酯酶(ChE)，血清一氧化氮 (NO)，血清內皮素 (ET)-1，凝血酶原時間 (PT)，部分凝血酶時間 (APTT)，凝血酶時間(TT)。

細胞因子：白介素 (IL)-10，IL-13，IL-27，病毒脫氧核糖核酸單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，巨噬細胞抑制蛋白-2(MIP-2)，紅細胞生成素 (EPO)，血清粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，轉化生長因子 (TGF)β1，TGFβ2，肝細胞生長因子 (HGF)，成纖維細胞生長因子 (FGF)。

血液流變學指標：門靜脈內徑 (DPV)，脾靜脈內經(DSV)，門靜脈最大血流速度 (PVX)，脾靜脈最大血流速度 (SVX)，門靜脈血流量 (PVF)，脾靜脈血流量 (SVF)。

分子生物學指標：肝星狀細胞 (HSCs)，α-SMA蛋白，Ⅰ型膠原蛋白 (ColⅠ)，Ⅲ型膠原蛋白 mRNA，Smad3表達，AGE受體 (RAGE)，NF-κB，p65 mRNA，RNAi，維甲類X受體α (RXR-α)，視黃醇類核內受體-α (retinoid X receptor-alpha，RXR-α) 基因，Hedgehog、MAPK、磷脂酰肌醇 3-激蛋白激酶B，SHAP-HA蛋白，腫瘤壞死因子 (TNF)-α，基質金屬蛋白酶組織抑制因子 (TIMP)-1，血小板衍生生長因子(PDGF)，基質金屬蛋白酶 (MMP)-1，pcDNA-gremlin，細胞凋亡相關因子Caspase-3，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)，CC趨化因子配體2(CCL2)，缺氧誘導因子，Th1/Th2極化，誘導型一氧化氮合酶 (iNOS)mRNA，col-Ⅰ基因，col-Ⅲ基因，腎素-血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)1型受體(AT1R)mRNA，熱休克蛋白 70(HSP70)，血漿內毒素，ED2，受體型蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTPRJ)，過氧化氫酶(CAT)，肝再生增強因子 (ALR)，ERK1蛋白。

免疫組化指標：Bcl-2表達，Bax表達，肝組織細胞核增殖抗原 (pcna)，蛋白酶活化受體 (PARs)1，PAR2，MMP-2，TIMP-2，纖溶酶原激活物抑制物 (PAI-1)，骨橋蛋白(OPN)，PLT，直接膽紅素 (DBil)。

肝組織指標：羥脯氨酸 (Hyp)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽 (GSH)，單胺氧化酶 (MAO)，丙二醛(MDA)，IL-17。

基因：α1腎上腺素受體1A亞型基因 (ADRA1A)，亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR)基因C677T，P22PHOX基因，(AT1R)基因A1166C，AT1R基因AC+CC基因型及C等位基因，醛固酮合成酶 (CYP11B2)基因T(-344)C，AT1R-810A/T，AT1受體基因mRNA，P2Y12基因TC/CC型，ACE基因DD基因型，內皮型一氧化氮合酶基因 (eNOS)，一氧化氮合酶基因 G894T(Glu298Asp)，血管緊張素Ⅱ2型受體(AGTR2)基因1675A/G，血管緊張素原基因M235T，血管壁Ⅰ型膠原蛋白和基因，SLC6A2基因啟動子3(promoter3，rs168924)，SLC6A2基因啟動子 2(promoter2，rs2397771)，血小板膜受體P2Y12基因G52T、-T744C多態性：TC/CC基因型，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)基因位點IVS6+G82A(G突變)，過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPARγ)C161T基因，心鈉素 (ANP)基因T2238C多態性及其C型受體 (NPRC)基因A-55C，內皮素-2(endothelin-2，ET-2)基因A985G，血管緊張素原 (AGT)基因T174M，eNOS G894T基因型TT型純合子。

其他指標：ⅳ型膠原 (ⅳ-c)，α2巨球蛋白 (α2ma)，γ谷氨酰轉肽酶 (GGT)，脂肪細胞刺激因子 (lsp)，γ球蛋白，人單核細胞趨化蛋白-3(mcp-3)，神經肽γ(NPγ)，血管活性腸肽 (VIP)，胰高血糖素 (Glu)，生長抑素 (SS)，兒茶酚胺 (CA)，血管加壓素 (AVP)，腦啡肽，腦利尿鈉肽或腦鈉肽 (BNP)，C型鈉尿肽 (CNP)，前列腺素 (PG)，激肽酶，腎上腺髓質素 (ADM)，醛固酮 (ALD)，血漿腎素活性 (PRA)，ET-1或 ET，NO，iNOS，前列環素 (PGI2)，血管內皮生長因子 (VEGF)，血管收縮因子 (EDCF)，血管舒張因子 (EDRF)，結締組織生長因子 (CTGF)，血栓素(TX)A2，TXB2，6-酮-前列腺素F1α (6-K-PGF1α)，降鈣素基因相關肽 (CGRP)，ANP，降壓肽類激素心鈉素(ANF)，P物質 (SP)，血漿β-內啡肽 (β-EP)，血漿硫化氫(H2S)，男性卵泡刺激素 (FSH)，黃體生成素 (LH)血小板-白細胞聚集PagT，高敏C反應蛋白或C應蛋白 (H-CRP或HsCRP 或 CRP)，IL-6，IL-1， 尿 N-乙 酰-β-葡 萄 糖 苷 酶(NAG)，肌酐 (Cr)，尿酸 (UA)，24小時尿蛋白 (24小時PRO)，外周血淋巴細胞過氧化物酶體增殖物激活受體γ信使核糖核酸PPARγ(mRNA)，酪氨酸羥化酶 (TH)，c-fos，總膽固醇 (TCh)，甘油三酯 (TG)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)，脂蛋白a(LP-a)，低密度脂蛋白自身抗體 (Ab-OX-LDL)，血友病因子(vWF)，P選擇素GMP-140，胰島素抵抗 (IR)，天冬氨酸(Asp)，γ-氨基丁酸 (GABA)，牛磺氨酸 (Tau)。

1.3 統計學方法 應用復雜網絡節點度技術進行計算機自動分析［8～10］。

1.3.1 確定復雜的網絡節點 根據生物指標詞典，識別每一篇文獻的生物指標，記為Ci= {v1，v2，v3……vi}，其中Ci表示第i篇醫學文獻中生物指標集合，把生物指標作為網絡節點。

1.3.2 確定復雜網絡的邊 根據節點同現關系，出現在同一篇文獻中的生物指標 (節點)是相互關聯，所有邊記為E={e1，e2，e3……ei}。

1.3.3 構建復雜網絡 根據所有文獻中識別到的生物指標節點以及節點關聯，構建生物指標的復雜網絡，記為G=［V(G)，E(G)］。

1.3.4 計算網絡節點度 節點度為頂點關聯的邊的數目，記為de(vk)。

1.3.5 網絡節點度排序 根據節點度的大小進行，從大往小排序，記為D={d1，d2，d3……dn}。最終獲取度數靠前的生物指標。

2 結果

2.1 生物指標關聯圖 見插頁圖1。

2.2 關聯度高的生物指標排序情況 見表1。

表1 頻次居前15位的肝纖維化患者證候與生物指標的關聯度

3 討論

3.1 分析結果 通過復雜網絡節點度技術，運用計算機自動分析，可以從海量文獻數據中將200個與肝纖維化相關中醫證候生物學指標范圍快速、準確地縮小到15個關聯度最高的核心指標，15個核心指標涉及類別主要是NEI網絡，肝臟疾病，肝纖維化，肝臟炎癥，是神經免疫內分泌整體與肝臟局部病變相結合的網絡系統，這正與肝硬化中醫證候肝藏血主疏泄，調暢情志、調儲血量、濡養肝及筋目的整體觀有一定的符合度。

3.2 數據挖掘技術評價 中醫證候對現代生物文獻的利用，常常受數據挖掘方法的限制，本課題采用一種可優選的技術方法，將200種以上的生物指標客觀、科學、快速地縮小至15個指標，可以更為深入有效地利用現有文獻數據庫，從中歸納總結現階段中醫藥研究的成果，從文獻挖掘的角度探討肝纖維化中醫證候與生物指標的相關性，探尋反映不同證候肝纖維化的共性病理改變以及各個證候所特有的病理特征的核心指標，為今后進一步進行多中心大樣本的證候與生物指標相關性的臨床研究提供參考。

3.3 問題與展望 由于肝纖維化與肝硬化在生物領域的兼夾，對該方法挖掘出來的關鍵生物指標還是需要臨床和基礎專家進一步在實際工作中進行選取，通過實驗不斷驗證應用。該研究成果也有可能拓展至其他病證結合領域的核心指標篩選過程，為中醫證候與現代科學關系的研究搭起一條新的橋梁。

［1］劉成海，危北海.肝硬化中西醫結合診治共識［J］.中國中西醫結合消化雜志，2011，19(4)：277-279.

［2］巫協寧.臨床肝膽系病學 (新版) ［M］.上海：上海科學技術文獻出版社，2002：440.

［3］黃耀煊.肝病分子生物學［M］.福州：福建科學技術出版社，2003：437.

［4］王吉耀.現代肝病診斷與治療 ［M］.上海：復旦大學出版社，2007：440.

［5］陳悅，龔作炯.肝臟疾病診療進展［M］.武漢：湖北科學技術出版社，2008：392.

［6］李發旺.中西醫結合診治：肝炎、肝硬化與肝癌［M］.蘭州：蘭州大學出版社，2008：320.

［7］蕭樹東.消化系疾病基礎與臨床進展［M］.上海：上海科學技術文獻出版社，2005：324.

［8］GIRVAN M，NEWMAN ME.Community structure in social and biological networks［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(12)：7821-7826.

［9］汪小帆，李翔，陳關榮.復雜網絡理論及其應用 ［M］.北京：清華大學出版社，2006：260.

［10］M.E.J.NEWMAN.The Structure and Function of Complex Networks［J］.SIAM Rev，2003，3(10)：167-256.