松弛素對肝纖維化大鼠的作用及對轉化生長因子-β1的影響*

周玉平 涂國卿 胡俊義 徐澤宇

1.南昌市中西醫結合醫院消化內科 (江西南昌，330003) 2.江西中醫藥高等專科學校醫療系

松弛素 (relaxin，RLX)是迄今發現的最強的內源性抗纖維化物質之一，也是最具前景的內源性抗纖維化物質［1］。RLX是體內廣泛分布的多功能活性多肽，早期研究發現，RLX能調節生殖系統功能和垂體激素分泌、促進大腦發育，維護心血管系統功能穩態。在腫瘤的發展和轉移及心血管疾病發病中也具有重要的病理生理意義。近幾年來，RLX強大的抗纖維化效應受人關注［2］。國外學者研究發現，RLX在肝硬化患者肝星狀細胞 (HSC)中也有表達，并且對阻止肝纖維化有明顯作用［3］。RLX抗肝纖維化的作用機制尚不清楚，本研究擬通過動物實驗研究松弛素的抗肝纖維化作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 36只健康雄性Wistar大鼠，清潔級，體重 (120±20)g，由江西中醫學院動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：JZDW No2010-0011。四氯化碳為國產分析純。橄欖油為山東魯花集團有限公司生產。轉化生長因子-β1(TGF-β1)ELISA試劑盒購自武漢博士德公司。rhRLX(重組人松馳素)為美國R＆D公司產品。Diagnostics酶標儀為美國Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和造模 大鼠先進行適應性飼養兩天后，采用隨機數字表法隨機分為3組，即正常組、模型組、松弛素組，每組12只。除正常組外，模型組和松馳素組大鼠采用CCl4造模，將CCl4制成50%橄欖油劑，按每公斤體重1ml的劑量在每只大鼠腹腔注射，第1周3次，第2周開始每周2次，共6周。正常組大鼠腹腔注射相同體積生理鹽水。各組大鼠均用普通飼料喂養，自由飲水。松弛素組大鼠在第6周，每天予重組人松弛素靜脈注射，劑量為2μg/kg，共用1周。

1.2.2 標本采集 實驗結束后，大鼠稱重，戊巴比妥鈉麻醉，打開腹腔，腹主動脈采血，離心分離血清后，-20℃保存備用。于肝左葉同一部位取肝組織標本約1×1×lcm3，固定于10%甲醛溶液。肝組織常規脫水，石蠟包埋，制作切片。另外留取500mg肝右葉組織，迅速置于預冷的生理鹽水中洗去血液后，置凍存管于液氮中速凍，-70℃ 冰箱內保存備用。

1.2.3 病理和臨床指標檢測 HE染色制作病理切片觀察大鼠肝組織損傷情況，并參照文獻方法對肝臟病理學改變進行半定量評價：0級：無纖維化;Ⅰ級：匯管區纖維化，炎性細胞浸潤，點、灶性壞死;Ⅱ級：纖維間隔形成，炎性細胞浸潤輕度，灶性壞死;Ⅲ級：纖維間隔伴小葉結構改變 (假小葉)，炎性細胞重度浸潤，灶性壞死，橋接壞死;Ⅳ級：少數結節形成 (早期肝硬化)，融合性壞死;依據各組大鼠肝纖維化的分級，按0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，Ⅳ級分別計1、2、3、4、5分的標準對大鼠肝纖維化進行評分［3］。采用全自動生化分析儀測定血清丙氨酸轉氨酶 (ALT)、天門冬氨酸轉氨酶 (AST)。采用放射免疫分析法檢測血清透明質酸 (HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原 (PCⅢ)、Ⅳ型膠原 (CⅣ)。指標檢測均由我校附屬醫院完成。

1.2.4 肝組織TGF-β1水平檢測 取大鼠肝組織，經預冷的生理鹽水洗滌后用眼科剪剪碎，加入4倍體積的裂解液，在勻漿管中小心勻漿，提取肝組織的總蛋白質，然后轉入EP管，4℃冰箱靜置30分鐘，12 000r/min、4℃離心30分鐘，取上清液。同組肝組織蛋白樣品合并成一個混合樣品，各混合蛋白樣品按bradford法進行蛋白質定量。肝組織TGF-β1檢測采用雙抗體兩步夾心ELISA法。操作按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟病理情況 實驗過程中模型組大鼠死亡2只，松弛素組大鼠死亡1只，死亡大鼠尸檢腹腔內見彌漫性化膿性炎癥，肝組織上附著大量白斑及膠原狀物質，組織學觀察見肝組織廣泛大面積壞死伴中性粒細胞浸潤。正常組大鼠肝組織HE染色見肝小葉結構完整，肝細胞無變性、壞死，匯管區無明顯纖維組織增生及炎性細胞浸潤。模型組大鼠肝組織HE染色見肝細胞排列紊亂，小葉內和小葉間有炎性細胞浸潤，部分肝細胞變性、壞死，匯管區及肝小葉內可見大量的纖維組織增生，并形成假小葉。松弛素組大鼠肝組織HE染色見大部分肝小葉結構正常，肝細胞壞死程度、纖維增生程度較模型組輕。

2.2 各組大鼠肝纖維化分級、評分情況 見表1。

表1 各組大鼠肝纖維化分級、評分比較

經秩和檢驗統計分析，各組大鼠肝纖維化評分分值由高到低依次為模型組、松弛素組、正常組，各組間比較，P均＜0.01。

2.3 各組大鼠肝功能及肝纖維化指標檢測結果 見表2。

表2 各組大鼠肝功能和肝纖維化指標檢測結果比較(±s)

表2 各組大鼠肝功能和肝纖維化指標檢測結果比較(±s)

與正常組比，▲P＜0.01;與模型組比，*P＜0.01

組別 n ALT(U/L) AST(U/L) HA(μg/L) LN(μg/L) PCⅢ (μg/L) CⅣ (μg/L)正常組 12 52.28 ±6.22 78.94 ±7.66 159.69 ±13.06 110.22 ±10.76 6.31 ±0.63 15.82 ±1.44模型組 10 108.21 ±9.57▲ 157.81 ±14.05▲ 354.12 ±22.26▲ 221.13 ±17.17▲ 46.36 ±4.05▲ 33.40 ±2.38▲松弛素組 11 64.51 ±5.05* 100.29 ±9.45* 181.66 ±14.13* 126.19 ±8.04* 20.99 ±8.33* 17.88 ±1.73*

2.4 各組大鼠肝組織TGF-β1檢測情況 見表3。

表3 各組大鼠肝組織TGF-β1水平比較(±s)

表3 各組大鼠肝組織TGF-β1水平比較(±s)

與正常組比，▲P＜0.01;與模型組比，*P＜0.01

組別 n TGF-β1(mg/L)正常組12 27.32 ±2.98模型組 10 55.37 ±4.68▲松弛素組 11 30.16 ±2.26*

3 討論

肝纖維化 (hepatic fibrosis，HF)是致病因子引起肝臟炎癥或損傷后組織修復過程中的代償反應，是繼發于各種肝臟損害后的組織修復過程，以細胞外基質 (ECM)在肝內過量沉積為病理特征［4］。目前研究認為HSC激活是肝纖維化的中心環節，激活的HSC是產生ECM并造成HF的主要細胞。盡管引起HF的原因多種多樣，但不同原因引起的HF都有著共同的特點：當各種致病因子作用于肝臟，受損肝細胞通過產生并釋放氧自由基、脂質過氧化物、蛋白酶、細胞因子和生長因子等，直接或間接地損害鄰近的肝臟細胞［5］，并引起肝Kupffer細胞、肝竇內皮細胞、血小板和肝細胞分泌更多種細胞因子，其中包括血小板衍化生長因子 (PDGF)、TGF-β、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、干擾素-γ (IFN-γ)、IGF(胰島素樣生長因子)、內皮素-1(ET-1)、連接蛋白和促有絲分裂原，與某些化學遞質共同作用于靜息狀態的HSC，使其激活［6］。激活的HSC在接受旁分泌進行自身增殖的同時，自身也分泌多種細胞因子，主要有成纖維細胞生長因子 (FGF)、肝細胞生長因子 (HGF)、ET-1，使其進一步激活，以維持和擴展其激活狀態。同時，激活的HSC在化學引誘物PDGF、單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、IGF和ET-1的作用下定向遷移并聚集至肝損傷部位，并大量合成ECM。ECM主要包括：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，蛋白多糖，硫酸軟骨素，硫酸皮膚素，透明質酸等。其中關鍵環節是在TGF-β等的影響下基質金屬蛋白酶 (MMPs)的活性下降，組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)的活性增加，導致ECM的降解減少，使得ECM大量沉積，最終導致肝纖維化［7］。

RLX是1926年Hisaw從懷孕的豬黃體細胞中提取的妊娠相關激素，能松弛恥骨韌帶、軟化宮頸，促進分娩。RLX是胰島素樣生長因子超家族的一員，在人及其他一些高等靈長動物體內有3種類型，分別為 H1、H2、H3，其中 H2是組織儲存及血液循環中存在的主要形式;在嚙齒動物存在兩種RLX類型，分別為 RLX-1(相當于 H2)和 RLX-3(相當于H3)。后來研究發現，在非妊娠期的婦女及男性體內多種組織都有RLX的表達，推測RLX不僅是一種生殖激素，可能還具有多種生物學效應。但直至2000年，人們利用同源分析的方法發現并克隆了孤兒受體 LGR7，隨后證實 RLX為其內源性配體，這一發現使RLX的功能研究進入了一個嶄新的階段，就此2002年，Science雜志就曾發表社評文章，指出對RLX功能的重新認識有著深遠的意義。

RLX是體內廣泛分布的多功能活性多肽，不僅調節生殖系統功能，還參與神經垂體激素的分泌、大腦發育和心血管系統功能穩態等廣泛生理過程，在腫瘤的發展和轉移及其心血管疾病發病中也具有重要的病理生理意義。

最近研究發現，RLX在肝硬化患者HSC細胞中表達增多，并且對阻止肝纖維化有明顯作用［3］。但是RLX的抗肝纖維化作用機制尚未深入探討。本研究結果再次證實，松弛素能顯著降低大鼠血清中ALT、AST水平 (P＜0.01)，改善肝功能;能顯著降低血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平 (P＜0.01)，降低大鼠肝纖維化程度。這與上述研究結果是一致的。本研究還重點研究了松弛素對肝組織TGF-β1水平的影響，結果說明，松弛素能顯著減少肝組織TGF-β1的表達，我們推測這可能是松弛素防治肝纖維化的重要機制。

［1］SAMUEL CS，HEWITSON TD，UNEMORI EN，et al.Drugs of the future：the hormone relaxin ［J］.Cell Mol Life Sci，2007，64(12)：1539-1557.

［2］SAMUEL CS，LEKGABE ED，MOOKERJEE I.The effects of relaxin on extracellular matrix remodeling in health and fibrotic disease［J］.Adv Exp Med Biol，2007，612：88-103.

［3］BENNETT RG，DALTON SR，MAHAN KJ，et al.Relaxin receptors in hepatic stellate cells and cirrhotic liver ［J］.Biochem Pharmacol，2007，73(7)：1033-1040.

［4］BATALER R，BRENNER DA.Liver fibrosis［J］.J Clin Invest，2005，115：209-218.

［5］SOKOL RJ.Liver cell injury and fibrosis ［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr，2002，35(1)：7-10.

［6］陳海濱，吳蔚，李文珠，等.肝纖維化機制及最新治療藥物研究進展 ［J］.臨床和實驗醫學雜志，2008，7(2)：164-165.

［7］SHEK FW，BENYON RC.How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis? ［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2004，16(2)：123-126.